螺旋腺瘤临床病理分析螺旋腺瘤临床病理分析.DOCVIP

临床医学论文-螺旋腺瘤临床病理分析螺旋腺瘤临床病理分析 【摘要】? 目的:研究高密度壳聚糖（high density chitosan，HDC）对小鼠L929细胞的毒性，以期为其临床安全应用提供依据。方法：观察不同浓度HDC浸提液对体外培养L929细胞形态的影响，四甲基偶氮唑蓝（methlthiazolyl tetrazolium,MTT）实验评价HDC对L929细胞生长和增殖的影响，流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测HDC浸提液对L929细胞凋亡的影响，单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis,SCGE）检测不同浓度HDC浸提液对培养的L929细胞DNA分子损伤的影响。结果：HDC浸提液对体外培养的L929细胞形态无明显影响，对细胞生长和增殖无明显抑制作用,不同浓度材料浸提液的细胞毒性均为01级；FCM示凋亡率随浸提液浓度升高而升高，但不明显;SCGE结果显示HDC对L929细胞的DNA无明显损伤作用。结论：HDC具有良好的细胞相容性和分子相容性，可为临床的安全应用提供依据。 【关键词】? 高密度壳聚糖 分子生物相容性 单细胞凝胶电泳 ??? 壳聚糖是一种可被降解吸收、具备良好生物相容性的高分子材料，具有多种作用[12]。其衍生物高密度壳聚糖（high density chitosan，HDC）由于还可被应用于填补骨缺损、治疗骨折及具比壳聚糖更明显的降血脂等作用而受到重视，并成为医学工作者研究热点之一，但其相容性评价鲜见报道。随着生物材料相容性研究逐渐向分子水平的迈进，生物材料评价逐渐进入整体、细胞和分子水平的全面评价阶段。为确保生物材料临床应用的安全性,本研究拟通过形态学观察、四甲基偶氮唑蓝（methlthiazolyl tetrazolium,MTT）实验、流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测和单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis,SCGE）来研究HDC浸提液对L929细胞的影响，进而评价HDC毒性、细胞相容性和分子相容性，期望能为其临床安全应用提供理论依据。 ??? 1? 材料和方法 ??? 1.1? 材料 ??? HDC(上海优品生物有限公司提供，脱乙酰度90%),L929细胞株(购自中科院上海细胞研究所)，RPMI 1640培养基（GIBCO公司提供），MTT（美国 SIGMA公司提供），低熔点琼脂糖（南京生兴生物技术有限公司提供），荧光显微镜（日本Nikon公司提供）。 ??? 1.2? 实验方法 ??? 1.2.1? HDC浸提液制备和实验分组 ??? 1.2.1.1? HDC浸提液制备? HDC经紫外照射灭菌后，按试样0.15 g·ml-1的质量浓度，在37℃、72 h条件下，浸提后过滤除菌保存备用，浸提介质为含10%小牛血清RPMI 1640培养基。 ??? 1.2.1.2? 实验分组? (1)阴性对照组,RPMI 1640培养液组；(2)～(5)25%、50%、75%、100% HDC浸提液组；(6)阳性对照组，0.7%聚丙烯酰胺单体(PVC)（SCGE实验阳性组为0.01 mol·L-1 H2O2组）。 ??? 1.2.2? HDC的毒性研究 ??? 1.2.2.1? 细胞形态观察? 0.25%胰酶消化对数生长期的L929细胞，传代后用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液及不同浓度(25%、50%、75%、100%)HDC浸提液培养细胞，然后分别于12、24、72 h倒置显微镜下观察细胞形态、细胞贴壁情况并拍照。（1）无毒：细胞形态正常，贴壁生长好，细胞呈梭形或不规则三角形。（2）轻度毒性：细胞贴壁生长好，但可见少数细胞圆缩，偶见悬浮细胞。（3）中度毒性：细胞贴壁生长不佳，细胞圆缩较多，达1/3以上，见悬浮死细胞。（4）重度毒性：细胞基本不贴壁，90%以上为悬浮死细胞。 ??? 1.2.2.2? MTT实验? 实验以RPMI 1640培养液稀释100%浸提液至所需浓度。将L929细胞复苏、传代后,于对数生长期经胰蛋白酶消化制成6×104 ml-1的细胞悬液，接种于96 孔培养板，24 h后换液，72 h 后加入MTT，4 h后加入二甲基亚砜(DMSO),震荡10 min后在免疫酶标仪上测定493 nm处光密度(optical density,OD)值。计算细胞增殖率(relative growth rate,RGR或proliferation rate，PR)。RGR(%)=实验组OD均值／阴性对照组OD均值×100%。根据RGR 进行细胞毒性分级:99≤RGR≤100时，细胞毒性为0 级；75≤RGR99时，细胞毒性为1 级；50≤RGR75时，细胞毒