植物GSTZ基因表达特性及酶定向进化研究.pdfVIP

摘要 摘要 谷胱甘肽s．转移酶Zeta类(GSTZ)是一种重要的多功能酶，与细胞生化代谢、 环境净化等密切相关。 酿酒酵母和毕赤酵母均表达出了具有活力的GSTZ酶。酿酒酵母所表达的 AtGSTZ、BnGSTZ-B和BnGSTZ．C比活力分别为5．3 U／rag、4．3U／mg和0．3U／mg， 低于前文报道的大肠杆菌表达系统及小麦胚芽无细胞蛋白质合成系统表达的酶 比活力，但酵母表达的不同种类的GSTZ比活力比值与大肠杆菌表达系统与小 麦胚芽无细胞蛋白质合成系统表达的基本一致。 根据毕赤酵母所表达的GSTZ酶活测定结果，初步推测可能在GSTZ诱导 过程中，培养液中产生了一种GSTZ的底物，该底物在GSTZ作用下生成的产 物可能导致实验中测量到较高A535值，下一步实验需要对该底物继续研究。 定向进化是一种改造蛋白质、获取进化分子的重要方法。以来自拟南芥的 AtGSTZ为原始基因，经过高错误倾向PCR和几轮DNA洗牌，建立了规模约为 105的基因突变文库。将突变基因插入大肠杆菌表达载体pET21b(+)，转化大肠 性克隆。随机选择10个酶表达量较高的克隆进行酶活测定和DNA测序。结果 显示碱基和氨基酸残基的突变频率分别为2．5％、2．6％，碱基突变类型主要是AT 对向GC对的转换，占总变异率的34．3％：氨基酸水平上，非极性与极性氨基酸 残基被替换的频率分别为46％和54％，氨基酸残基突变后极性不改变的百分比 为65％。所有具有酶活力的突变体的活性氨基酸残基位点均未发生突变，暗示 了活性位点具有高度的保守性；结构域间相互作用位点的氨基酸残基发生了个 别替换，但均为疏水氨基酸残基替换，没有影响酶的整体结构。 GSTZ 关键词： 表达 二氯乙酸脱氯反应(DCA-DC)定向进化 Abstract Abstract TheZetaclassofghitathione isall S-transferase(GSTZ)，whichimportant totheceilmetabolismandcontaminationelimination． multifunctiona[enzyme，relates TheGSTZ from thalianaL．andBrassicaL．cv．Shah genes Arabidopsis napus KenC1 the siteofthevector and 2Band wereclonedinto multi—cloning pYES2 and recombinantwereisolatedintroducedintothestrain pPlC9．The plasmids rNCSclof CerevisiaeandthestrainGSl15 ofPichiaPastoris Saccharomyces were botllin GSTZswell Cerevisiaeand respectively．All expressedSaccharomyces in Pastorisasan form．The Pichia active ofAIGSTZ．