血管紧张素Ⅱ和胰岛素对平滑肌.pptVIP

血管紧张素Ⅱ和胰岛素对平滑肌细胞三磷酸肌醇活性的影响 天津医科大学第二医院心脏科 马向红 前 言 肾素-血管紧张素系统在高血压的发病机制中具有重要作用，临床研究发现高血压患者较正常血压者更易发生糖尿病，糖尿病患者发生高血压的危险性高于血压正常者，高血压和糖尿病患者常表现为胰岛素抵抗。 血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素1型(AT1)受体拮抗剂不仅能降低血压，而且能提高胰岛素的敏感性，提示血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）与胰岛素抵抗之间具有相互作用。 前 言 AngII可以激活磷脂酶水解细胞膜磷脂并产生信号分子，在培养的平滑肌细胞5秒钟之内PLC被激活，水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）生成肌醇1，4，5-三磷酸 (inositol trisphosphate, IP3)和二酰甘油(diacyl glycerol, DG)。 IP3和DG作为第二信使分别激动两个信号传递途径即IP3/Ca2+和DG/PKC通路，IP3通过作用于内质网膜上特异的受体使其内部Ca2+释放，引起胞内Ca2+水平增加，从而启动胞内Ca2+信号系统，即通过依赖Ca2+、钙结合蛋白（如钙调素）的酶类活性变化来调节生理过程。 前 言 然而，AngⅡ与胰岛素同时存在情况下对IP3和钙调素活性的影响目前尚不十分清楚。本文旨在探讨AngII和胰岛素对人脐动脉平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响。 材料和方法 人脐动脉平滑肌细胞培养和鉴定：采用组织贴块法，?-actin免疫组织化学检查细胞胞浆呈棕褐色鉴定为平滑肌细胞。 第2-3代细胞用于实验，用胰蛋白酶消化后接种于24孔培养板，浓度为2×106/ml。静置24小时后换成无血清细胞培养液，孵育24小时使细胞处于静止状态再进行实验。 实验分组： 对照组，为无血清的M1640培养液 不同浓度胰岛素组(10、100、1000mU/L) 不同浓度血管紧张素Ⅱ组（0.1 nM、0.5nM、1nM） 不同浓度胰岛素(10、100、1000mU/L)+不同浓度AngⅡ组（0.1 nM、0.5nM、1nM） 不同浓度AngⅡ组（0.1 nM、0.5nM、1nM）+不同浓度losartan组（1、5、10μM） 每组为6孔细胞。 检测方法：实验24小时后刮取细胞测定钙调素(CaM)和三磷酸肌醇（IP3）。 钙调素测定：采用磷酸二酯酶（PDE）法。 贴壁培养的人脐动脉平滑肌细胞，用预冷的PBS缓冲液洗3遍，用细胞刮将细胞刮下，制成细胞悬液，细胞数为2?106/ml。 加入50?l PDE混合液，混匀，30?C 预热10分钟。 加入100?l反应混合液，30?C水浴20分钟，煮沸1分钟。 立即放入冰水浴中，加入1mg/ml蛇毒50?l，混匀，放置30?C水浴中保温20分钟。 加入30% Dowex 400?l，混匀，1000转/分离心10分钟，取上清液200?l置于闪烁瓶中。 加入3ml无水乙醇和7ml闪烁液，于?液闪计数仪中测定cpm，根据标准曲线计算出钙调素含量。 IP3测定：6孔板培养的平滑肌细胞，加入3H-肌醇 （10?Ci/孔，由中国原子能研究院标记）和不同浓度的胰岛素、AngⅡ和Losartan培养24小时。 弃去培养液，用预保温的反应缓冲液洗1次，弃去。 用2ml反应缓冲液37 ?C孵育10分钟，弃去，重复一次。 加入氯仿/甲醇/盐酸（1:2:0.25，V/V/V）1ml终止反应。 刮取细胞，收集细胞于离心管中，加入0.6ml氯仿/水（1:1，V/V），振摇。 1000转/分离心5分钟，70?C水浴保温10分钟取出氯仿，收集水相层（约0.4ml）于柱中。 先后经过10ml双蒸水，10ml 60mM甲酸铵/5mM硼酸钠、10ml 0.2M甲酸铵/0.1M甲酸、10ml 0.7M甲酸铵/0.1M甲酸、10ml 1.05M甲酸铵/0.1M甲酸逐步洗脱。 流速3-4滴/分钟。 收集1.05M甲酸铵/0.1M甲酸过柱后含有IP3的洗脱液。 取2ml洗脱液于闪烁瓶中，60?C蒸发至残余液体约200?l，加入闪烁液和无水乙醇，?液闪仪计数，IP3以cpm/孔表示。 统计学处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS10.0统计软件处理，多组间比较用方差分析，两两比较用q检验。p0.05具有统计学差异。 表1 胰岛素对平滑肌细胞I