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华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 p73 转录水平在苯并(a)芘致 MRC-5 和 H1299 细胞死亡中的作用 硕士生：饶凯敏  导  师：袁晶 教授  华中科技大学同济医学院公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系 教育部环境与健康重点实验室  摘  要  多环芳烃类化合物(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)在环境中分布广 泛。其中苯并(a)芘(benzo[a]pyrene, BaP) 是 PAHs 中最具代表性的环境致癌物。它 主要来源于交通运输、工业生产以及生活环境中有机物的热分解与不完全燃烧。 流行病学研究表明：BaP 的暴露与人类多种肿瘤的发生有关，如肺癌和皮肤癌。实 验研究发现 BaP 可阻断细胞生长分化调节的信号转导，与 DNA 形成加合物，导致 细胞周期阻滞和细胞死亡。 细胞死亡包括细胞凋亡和细胞坏死两种形式。细胞凋亡是细胞自发的、程序 性的死亡过程。坏死则是因病理而产生的被动死亡。当调控细胞凋亡的细胞因子 受抑制时，细胞的死亡形式则可能由凋亡转为坏死。研究证据显示：抑癌基因 p53 介导的细胞信号通路参与 BaP 致细胞增值和凋亡中的调控。但是，p73 在 BaP 致 细胞死亡中的调控机制仍有待深入研究。 p73 是 p53 的重要家族成员成员之一。它在结构和功能上与 p53 有相似性。p73 可激活 p53 下游调控细胞周期和凋亡的靶基因，从而参与 BaP 致细胞 DNA 损伤的 应答反应。然而，p73 与 p53 在功能与激活机制上也有差异性。p73 能否独立于 p53 而介导 BaP 诱导的细胞凋亡和坏死尚无确切报道。 基于此，本研究以人胚肺成纤维细胞(MRC-5)和 p53 缺失的人肺腺癌细胞 (H1299)为靶细胞，设定 BaP 染毒组(8 μM、16 μM、32 μM、64 μM 和 128 μM )、 溶剂对照组(S9+DMSO+含%5 血清培养基(S9 终浓度为 3‰ DMSO 终浓度1‰)和 空白对照组处理细胞 24 h。用 MTT 实验和单细胞凝胶电泳技术分别评价细胞的活 力和靶细胞 DNA 的损伤程度。同时，用流式细胞术评价 BaP 对靶细胞细胞周期阻 2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 滞和死亡的影响。用实时荧光定量 PCR 技术检测 p73 主要上游基因及其下游细胞 死亡和周期阻滞相关基因的 mRNA 水平，可望为进一步研究篇 p53 非依赖性信号 通路在 BaP 致细胞死亡中的调控作用提供科学线索。本研究主要结果如下： 1． 细胞活力实验 用设定浓度的 BaP 染毒(8 μM、16 μM、32 μM、64 μM 和 128 μM )处理 MRC-5 和 H1299 细胞 24 h 时。在 MRC-5 细胞，与溶剂对照组相比，除 8μM BaP 染毒组 外，其它 BaP 处理组细胞的存活率均显著下降(P0.05)；128 μM BaP 染毒组的细 胞存活率降低了 30%。在 H1299 细胞，所有 BaP 染毒组的细胞存活率均显著性降 低(P0.05)，并呈剂量-效应关系。相对溶剂对照相细胞而言，32 μM BaP 染毒组细 胞的存活率降低了 40%。 2． 单细胞凝胶电泳实验 用设定浓度的BaP分别染毒MRC-5细胞和H1299细胞24 h。在MRC-5细胞，与 溶剂对照组相比，各BaP处理组细胞的DNA损伤程度均显著增加(P0.01)，峰值在 在64 μM BaP染毒组。在H1299细胞，BaP致DNA损伤程度是随着染毒浓度的增加 而显著增加(P0.01), 有剂量-效应依赖关系。 3．流式细胞术实验 用设定浓度的BaP分别染毒MRC-5细胞和H1299细胞24 h，用流式细胞术检测 各时相细胞数。在MRC-5细胞，与溶剂对照组相比，BaP主要引起G1期细胞阻滞。 所有染毒组的凋亡细胞数量与溶剂对照组相比均无显著性差异(P0.05)。但是，所 有染毒组的坏死细胞数量百分比与溶剂对照组相比均显著性增加(P0.05)。在 H1299细胞，BaP引起的细胞周期阻滞则主要在G2期。所有BaP染毒组的坏死细胞 数量百分比与溶剂对照组相比均显著性增加(P0.05)；相对MRC-5细胞的各染毒组 均显著性升高(P0.05)。但是，凋亡细胞数仅在128 μM BaP染毒组有显著性增加 (P0.05) 。 4．实时荧光定量 PCR 实验 用设定浓度的 BaP 染毒 MRC-5 细胞 24 h，除 16 μM BaP 染毒组外，其它染毒 组 ATM 基因 mRNA 表达水平均显著增加(P0.05)。E2F1 和 Bcl-2 基因 mRNA 仅 在 16 μM 和 128 μM BaP 染毒组有显著性表达(P0.05)