源于Pseudomonas sp17的甲基对硫磷水解酶基因的克隆及原核表达.docVIP

东北农业大学 硕士学位论文 源于Pseudomonas sp.1-7的甲基对硫磷水解酶基因的克隆及原 核表达 姓名：许丽 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：王立群 摘 摘  要 要  甲基对硫磷是一种产量大，应用广泛的高毒有机磷酸酯类杀虫剂，广泛应用于农业生产、 植物保护过程中，对水稻、棉花、玉米等农作物上的多种害虫具有强烈的杀虫效果。但它对 人类和非目标有机体的损害作用巨大，已造成了严重的全球性环境污染和生态破坏，在发展 中国家尤为严重。人们发现自然环境中的微生物能够降解以甲基对硫磷为代表的有机磷农药， 这一发现为消除有机磷农药造成的污染提供了更好的途径。目前已报道了多种可降解甲基对 硫磷的菌株，主要有假单胞菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、蜡样芽孢杆菌属、苍白杆菌属、 灵杆菌属、产碱菌属和节杆菌属，并且研究了甲基对硫磷的代谢途径。研究中发现环境中的 微生物之所以能降解农药是因为它们能分泌一种能水解磷酸酯键的酶—有机磷降解酶。甲基 对硫磷水解酶是目前为止研究的比较清楚的一种有机磷水解酶，它最适合的底物是甲基对硫 磷。到目前为止利用分子生物学技术已经克隆得到多种甲基对硫磷水解酶的基因，研究人员 将克隆得到的甲基对硫磷水解酶基因进行了异源表达，并对重组酶进行分离纯化以及酶学性 质的研究。 本研究从农药厂的污水处理池的活性污泥中分离到一株高效降解甲基对硫磷的菌株 1-7，利用 PCR 扩增该菌的 16S rDNA，根据其 16S rDNA 序列分析发现它属于假单孢菌属 （Pseudomonas sp.）。经研究发现，此菌能组成型分泌甲基对硫磷水解酶 OPHC3,该酶可以将 甲基对硫磷分解为对硝基酚（PNP）。而且，在对 Pseudomonas sp.1-7 进行液体培养后发现它 能够进一步利用对硝基酚（PNP）,最终将甲基对硫磷彻底降解为无毒物质。 为 了 获 得Pseudomonas sp.1-7 降 解 甲 基 对 硫 磷 的 基 因 ， 我 们 利 用 鸟 枪 法 构 建 了 Pseudomonas sp.1-7的基因组文库并利用含有甲基对硫磷乳液的功能性平板筛选到阳性菌 株，插入片段长度为8Kb，测序分析得到编码甲基对硫磷水解酶的基因ophc3，该基因全长为 975bp，（G+C）含量为63%，有一个开放阅读框，编码324个氨基酸，其中前24个氨基酸残基 为信号肽序列。通过分析编码基因的氨基酸序列，发现与目前已发表的有机磷降解酶基因 ophc2编码的氨基酸序列的同源性最高，达到98%，而与甲基对硫磷水解酶基因mpd编码的氨 基酸序列的同源性均在50%以下。ophc3基因已经在GenBank中登录，登录号是FJ821775。 为了研究甲基对硫磷水解酶基因 ophc3 生物学功能，将带有信号肽的编码序列连接到原 核表达载体 pET-30a 上，构建原核表达重组质粒 pET-ophc3 ,将其转化大肠杆菌 BL21，酶活 测定结果表明，原核表达后的产物具有正常生物学功能。 为了研究重组酶蛋白的酶学性质，将原核表达的重组酶蛋白利用 Ni-NTA 柱进行纯化， SDS电泳显示纯化蛋白为单一的条带，利用纯化后的酶测定重组酶的酶学性质。结果表 明，该甲基对硫磷水解酶的分子量为 36KD，最适反应温度为 45，最适 pH 值为 8.0。37 时 OPHC3 对甲基对硫磷的米氏常数（Km）为 78.9 μmol/L，其最大反应速度（Vmax）为 3.0 μmol/L分钟。大多数金属离子对该酶的酶活性影响不大，SDS 完全抑制该酶的酶活性。 I 东北农业大学理学硕士学位论文 关键词：基因克隆；原核表达；甲基对硫磷水解酶；酶学性质 II Absract Cloning and Prokaryotic Expression of a Methyl Parathion Hydrolase Gene from Pseudomonas sp.1-7 Abstract Methyl parathion was widely used as a organophosphate insecticide throughout the world and had made a great contribution to agriculture and plant protection. It was used to control destructive insects for crop such as rice、cotton、corn，but it caused enormous damage to non-target organisms and have resulted in global environmental c