纳米材料分离富集低丰度蛋白多肽以及MALDI质谱鉴定的新方法研究.pdf

复旦大学博士后出站报告 摘要 分析与鉴定低丰度蛋白是蛋白质组学研究的重点和难点内容之一，复杂生物 体中，高丰度蛋白和低丰度蛋白浓度范围可高达108甚至更高，如何有效地分离、 富集、鉴定是摆在科研工作者面前的一道难题。 基质辅助激光解析离子化(MALDI)质谱因其分析速度快、灵敏度高、易于 操作等特点成为研究生物大分子的有效工具，但是存在于分析样品以及基质如盐 份、表面活性荆或其它非蛋白质成分之间的压制效应使得质谱灵敏度大大降低。 纳米材料因其大的比表面积，丰富可调的表面性质以及良好的离子交换性 能，可高效地富集低浓度蛋8／多肽，而且能抵抗样品中高浓度盐(如氯化钠、 尿素等)对质谱鉴定的干扰。另一方面，交换金属离子的纳米沸石材料可亲和吸 附蛋白的某些特定氨基酸，实现对目标蛋白的分离与鉴定。 本论文第一部分工作集中于几种纳米材料对低丰度蛋白／多肽的富集以及一 牛血清白蛋白酶解肽段，发现s—l型沸石的富集效果最好，富集倍数可达100倍。 说明沸石通过Si．O键利用库仑作用力对生物大分子进行吸附。由于全硅型S—l 沸石富集肽段的效果最佳。我们研究了氧化硅纳米材料在蛋白富集中的应用，得 到了很好的实验结果。纳米氧化硅材料在富集样品的同时可以抵制高浓度的无机 盐以及有机盐的干扰。而通常用的ZipTipTM脱盐和传统的耙上脱盐除盐能力有 限，远不能和纳米氧化硅脱盐效果相比。对纳米氧化硅富集蛋白混合物的研究发 现蛋白质在富集过程中存在着竞争关系。通过对蛋白质酶解肽段的富集研究发现 肽段的等电点以及亲疏水性都与富集有关系。 本论文第二部分工作首次应用交换金属离子的纳米沸石材料选择性富集磷 酸化肽段根据MALDI串级质谱进行磷酸化位点的研究。利用纳米沸石不仅有大的 外表面积而且其易于修饰的特点，将表面修饰Fe”的B类型沸石首次应用到分离 富集磷酸化肽段的领域。根据固定化金属亲和层析原理，Fe”选择性吸附磷酸肽。 实验中将结合有磷酸肽的纳米沸石直接点样，进行MALDI质谱分析，检测到 2+10’8M B，casein中的单磷酸肽，并得到很好的串级质谱信息。直接点样的操作 既简化了实验步骤，又避免了洗脱过程中磷酸化肽段的损失。 4 复旦大学博士后出站报告 纳米材料富集低丰度蛋白／多肽并一步除盐研究以及Fe3+修饰的纳米沸石富 集磷酸肽MALDI质谱鉴定研究不仅为蛋白质组学中蛋白分离和富集以及蛋白质 磷酸化的鉴定提供了操作简单易行的方法，也为纳米材料的研究应用提供全新的 视角。 关键词：纳米沸石材料：低丰度蛋白：基质辅助激光解析离子化质谱；富集 除盐；磷酸肽；固定化金属亲和层析 复旦大学博士后出站报告 Abstract The oflowabundancehas tobeadifficult analysis proteinsproven analytical sincethereisno forthe of problem techniqueamplification isolationandenrichmentoflowabundanceis for proteinsimportantproteome research． Matrix—assistedlaser is desorption／ionization(MALDI)massspectrometrywidely usedforthe ofbiomoleculessuchas and the analysis proteinspeptides．However effectsbetween mo