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玉帘凝集素的分离纯化、部分性质研究及分子克隆 专业：生物化学与分子生物学 硕士研究生吕辉 指导教师鲍锦库 Herb candida 摘要：本文对玉帘凝集素(ZephyranthesAgglutinin，ZCA)的 研究分为两个部分。第一部分为ZCA的分离纯化及部分性质研究；第二部分 为zCA的分子克隆及序列分析。 玉帘球茎经捣碎、生理盐水浸取、硫酸铵分级沉淀、DEAE—Sepharose离 S-100分子筛层析可纯化到ZCA纯品，经SDS—PAGE 子交换层析、Sephacryl S-100分子筛凝胶过滤测得ZCA的表观分 检测为单一蛋白染色带。Sephacryl 子量为48KD，SDS显示其亚基分子量约为125KD，证明ZCA分子为由 四个相同亚基组成的四聚体，用比色法测得每分子ZCA含有122个色氨酸残 基，即每个亚基有3个，且色氨酸残基均位于分子表面或浅沟内。 ZCA具有很强的兔血凝集活性，在浓度为0．95 u∥ml时仍能凝集兔红细 胞，同时ZCA还具有凝集大肠杆菌和多种酵母细胞的作用。甘露聚糖和猪甲 状腺球蛋白对ZCA的兔红细胞凝集活性有明显的抑制作用。研究了不同温度和 pH对ZCA的荧光光谱和兔血凝集活性的影响，结果表明温度在80。C以上时分 2时分 4和pHl 子构象发生了较大变化，但凝血活性仍保留50％的活性；在pH 2时，凝血活性仍保留 子构象发生较大变化，但凝血活性只下降了27．3％，在pH 55％。所以ZCA具有很强的温度和pH耐受性。 荧光淬灭研究表明CsCl可以淬灭71％色氨酸的荧光，化学修饰实验表明 N一溴代丁二酰亚胺(NBs)修饰色氨酸和2，3一丁二酮修饰精氨酸后，ZCA凝血活 性明显下降，Ser／Thr被修饰后，凝血活性无明显变化．ZCA抗病毒实验结果 u u 表明，ZCA溶液在浓度为500 g／ml时无细胞毒性，浓度为5g／ml以上时有 u 抗HSV-II活性，Ic；。=5一10g／m1之间。 使用ABl491A蛋白测序仪测定ZcA的N一端和c～端部分序列显示，N-末端 酸残基的序列为：G—T—A—w—K—A—P．与石蒜科其它甘露糖结合凝集素序列进行比 较，发现有较高的同源性． 依据ZCA的N一端部分氨基酸设计简并引物，通过反转录、RT-PCR与3’～ 末端快速扩增法(3’-RACE)和5’～末端快速扩增法(5’一RACE)扩增得到 终止密码子位于544--546bp处。5’端非翻译区长为94bp，其后还有一段真核 生物mRNA所特有的poly(A)序列。根据对ZCA的N一末端和c一末端部分氨基 酸序列的测定，发现ZCA基因编码一前体蛋白：含有信号肽序列、成熟蛋白序 7KD。 列和c一末端剪切序列。成熟蛋白由106个氨基酸残基组成，分子量为1I 经在NCBI上的Blast进行比较发现，该成熟蛋白编码氨基酸序列与雪花莲凝 集素(GNA)同源性达到75．2％，与水仙凝集素同源性为72．4％：与石蒜凝集 素同源性为76．2％，与君子兰凝集素同源性为76．2％。在blocks数据库 (w岍v．blocks fhcrc．org)中检索ZCA蛋白氨基酸序列的结构域，发现ZCA氨 基酸序列中存在三个凝集素功能结构域区，并具有3个典型的甘露糖专一结合