亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因的研究.pdfVIP

摘 要 从单雌蜱繁殖群中选出未吸血雌成蜱60只，随机分成两组，一组半饱血，另一 组不吸血。分离未吸血和半饱血两状态下的蜱唾液腺。经过总RNA提取，第一链合成、 长距离扩增、Ras I酶切、添加接头，扣除性杂交和选择性扩增等步骤，分离出差异 表达基因的eDNA片段。将第二次扩增产物的纯品插入pGEMT-Easy载体，转化DH5a 感受态。通过克隆鉴定和序列测定，获得120个有效片段，其中84个认定为序列表 腺表达，未吸血的不表达。 与NCBI数据库的片段进行序列比对，结果如下：文库里的120个片段中，90个 找到了具有一定相似性的序列，其中与其他蜱的已知基因具有相似性的片段21个， 与按蚊、库蚊、钩虫、奥斯特线虫等其他吸血寄生虫基因有一定相似性的片段19个。 有相似性的EST中筛选而来。 唾液腺只在吸血时表达两基因。 I 将GP。。基因的阅读框序列插入pGEx一4T一1构建重组表达载体。诱导后，重组质 粒转化的宿主菌(DH5n和BL21)表达出一个与预计大小一致的蛋白。肽指纹和肽片 段序列分析表明；受检样品中有8个肽片段源于GST，2个与目的蛋白％推导出的酶 的多肽两部分共同组成的融合蛋白。 为抗融合蛋白抗体所识别。表达形式分析显示，由融合蛋白以包涵体形式在大肠肝菌 内表达。 关键词：亚洲璃眼蜱唾液腺，差异表达基因文库，GP”基因，GP—s基因，克隆，表达 II Abstract 60 asiaticum fornl Hyalomma femaleadultticksselectedalaboratoryare colony dividedintotwo oftheunfedand ticksare groups．Thesalivary glands partiallyengorged dissected．AfterthethetotalRNA strandcDNA first andits preparation，the synthesis LD-PCR，theRsa cDNA，the of ofthe or amplificationby I-digestion ligationadapter-1 totester andselective adapter-2RcDNAs，subtractive hybridizations differentiallyexpressedsequenceshave PCR ere into vector，andthe secondaryamplification T-Easy lagatedpGEM resutting recombinantPlasmidsaretransformedinto DH5acompetent and