慢病毒介导shRNA 沉默鼠肝星状细胞TGFβ1 对α1Ⅰ 型胶原表达的影响.pdfVIP

第３６卷第５期 第　三　军　医　大　学　学　报 Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．５ ４５６ ２０１４年３月１５日　　　　　　　　　　 Ｊ　Ｔｈｉｒｄ　Ｍｉｌ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ 　　　　　　　　　　Ｍａｒ．１５　２０１４ 论著 文章编号：１０００５４０４（２０１４）０５０４５６０５ 慢病毒介导ｓｈＲＮＡ沉默鼠肝星状细胞ＴＧＦ１对 １ 型胶原表达的影响 β α Ⅰ １ ２ １ ２ １ 张荣华 ，闫国和 ，汪国建 ，粟永萍　　（４０００３８重庆，第三军医大学：西南医院中西医结合科 ，军事预防医学院全军复合伤 ２ 研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室 ） 　　［摘要］　目的　构建大鼠转化生长因子 １（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＴＧＦ１）基因ＲＮＡ干扰慢病毒载体，并观测其 β β 对大鼠肝星状细胞ＨＳＣＴ６的ＴＧＦ１基因沉默效应与对 型胶原 １（ａｌｐｈａ１ｔｙｐｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｃｏｌ１１）表达的影响。方法 β Ⅰ α Ⅰ α 　 针对大鼠ＴＧＦ１基因ＣＤｓ序列，筛选３个干扰靶点，合成其３对小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），将各对ｓｉＲＮＡ分别转入ＨＳＣＴ６ β 细胞，采用ＲＴＰＣＲ法从３对ｓｉＲＮＡ中筛选出最佳ｓｉＲＮＡ，设计并合成针对最佳ｓｉＲＮＡ靶序列的ｓｈＲＮＡ，退火形成双链，与 载体ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ连接，构建ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ／ＴＧＦ１ｓｈＲＮＡ慢病毒载体，予以酶切与测序鉴定。ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ／ＴＧＦ１ｓｈＲＮＡ慢病 β β 毒载体经２９３细胞包装，将包装产生的高感染力的慢病毒颗粒感染ＨＳＣＴ６细胞，倒置显微镜观察经感染的ＨＳＣＴ６细胞 的ＧＦＰ表达情况，在ｍＲＮＡ与蛋白水平检测重组慢病毒ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ／ＴＧＦ１ｓｈＲＮＡ对ＨＳＣＴ６细胞的ＴＧＦ１基因的沉默 β β 效应及对Ｃｏｌ１１表达的影响。结果　 筛选到ＴＧＦ１基因的最佳干扰靶序列。酶切与测序结果证实，构建ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ／ α β ＴＧＦ１ｓｈＲＮＡ慢病毒载体成功。ＨＳＣＴ６细胞经ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ／ＴＧＦ１ｓｈＲＮＡ慢病毒感染４８ｈ后，ＲＴＰＣＲ检测未见ＴＧＦ１ β β β 基因表达，Ｃｏｌ１１基因较弱表达；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测显示ＴＧＦ１、Ｃｏｌ１１蛋白表达均非常弱。结论　 成功构建大鼠ＴＧＦ１ α β α β 基因ＲＮＡ干扰慢病毒载体，该载体能有效沉默ＨＳＣＴ６细胞的ＴＧＦ１基因，并抑制Ｃｏｌ１１的表达。 β α 　　［关键词］　 转化生长因子 １； 型胶原 １；ＲＮＡ干扰，小分子；慢病毒载体 β Ⅰ α 　　［中图法分类