miR21真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响.pdfVIP

·6 · 中国癌症防治杂志2013年3月第5 卷第1期 Chin J of Oncol Prev and Treat，Mar 2013，Vol.5，No.1 基础研究 miR鄄21真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响 吟 孙阳阳 丁 骏 周晓丽 朱逸之 吟 作者单位：213003 常州 南京医科大学附属常州市第二人民医院病理科；南京医科大学附属常州市第二人民医院 肿瘤中心实验室 】 。 【摘要 目的 探讨人微小RNA鄄21（miR鄄21）重组表达质粒对人胃癌SGC鄄7901细胞增殖与凋亡的影响及可能机制 方法 设计合成靶向miR鄄21的互补双链DNA，退火后与真核表达载体pPG鄄miR鄄EGFP克隆连接，构建pPG鄄miR鄄21鄄EGFP重组 TM 表达质粒，利用脂质体Lipofectamine 2000将鉴定正确的重组表达质粒pPG鄄miR鄄21鄄EGFP转染人胃癌SGC鄄7901细胞， 荧光显微镜下观察转染效率。实验分为3组：空白对照组、空载体组、重组表达质粒组。以RT鄄PCR检测转染前后胃癌细 。 ，流式细胞术及 胞miR鄄21的表达水平 MTT法评价重组表达质粒抑制肿瘤细胞生长的效果 Hoechst33258法检测转染后 。 胃癌SGC鄄7901细胞周期的分布和凋亡 Western blot法、免疫细胞化学法分别检测转染前后PTEN、PCNA、PDCD4、bcl鄄2、 。 cyclin D1蛋白表达的水平 结果 酶切及测序鉴定证实成功构建重组质粒pPG鄄miR鄄21鄄EGFP，转染人胃癌SGC鄄7901细 ，与 胞后，荧光显微镜下观察转染效率达75%。RT鄄PCR检测显示重组表达质粒组胃癌细胞miR鄄21的表达下调 空白对照 （ 组和空载体组比较，差异具有统计学意义 P0.05）。Western blot法、免疫细胞化学法检测结果显示重组表达质粒组胃癌 （ 而 （ 细胞cyclin D1、PCNA、bcl鄄2蛋白的表达下调 P0.05）， PDCD4、PTEN蛋白的表达上调 P0.05）。重组表达质粒组的细 ， 胞生长缓慢 凋亡指数增加。流式细胞术检测结果显示重组表达质粒组G1 期细胞的百分比较空白对照组增加［（69.71依 0.314）%vs （50.1依0.331）%］，S期细胞较空白对照组明显减少［（14.68依0.448）%vs （28.47依0.316）%］（P0.05）。结论 重 组表达质粒pPG鄄miR鄄21鄄EGFP可显著下调miR鄄21在胃癌SGC鄄7901细胞中的表达，并在一定程度上抑制胃癌细胞的增 ， 使 ， 殖 促进其凋亡， 较多的细胞停留在G1 期 S期细胞减少，其作用机制可能是通过下调cyclin D1、PCNA、bcl鄄2蛋白的 表达，上调PDCD4、PTEN蛋白的表达而实现的。 【关键词】胃肿瘤