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蟾蛤毒素是传统中药蟾酥中的主要有效成分,由于各种蟾酥
制剂为混合制剂,制剂制法不同,缺乏质量控制标准,缺乏多中
心、大样本的观察,故对蟾酥制剂抗肿瘤的疗效难以判定,且大
剂量时毒副作用较大。蟾酥中主要含有蟾毒色胺类
(bufotenidines)和蟾毒配基类 (bufogenins)。在蟾酥抗肿瘤作
用中起主要作用的是蟾毒配基类及其酷类。国外研究表明蟾毒内
醋的成分之一bufalin对不同阶段、很多种类的白血病细胞、实
体瘤细胞都有抑制和诱导分化作用。但其它成分的作用及bufalin
的作用机理尚不清楚。
本实验的目的是采用不同方法将蟾蛛耳后腺及皮肤腺分泌物
进行部分分离纯化,比较各组分对白血病细胞的作用。以期制备
抗白血病作用大而毒副作用较小的可育罐临床应用的药物。
一 实验祠f=}及仪器
中华大蟾蛛,bufalin,碘化丙咤,RNAse,硅胶层析柱,200
目硅胶,18碳微粒硅胶,CO,培养箱,BectonDickinson流式细
胞仪,沃特斯液相色谱仪
二实验方法
1.分离纯化及高效液相色谱分析
(1) 分离提取及部分纯化:
采用特殊工艺提取蟾蛛耳后腺及皮肤腺分泌物冻存。分别浸
泡于80%乙醇回流4小时,及浸泡于氯仿室温下放置72小时后
过滤,取其滤液经减压蒸馏后及硅胶柱层析法。
(2) 高效液相色谱分析:
将层析产物分别溶于无水乙醇,制成 1毫克毫升的溶液,
进行反相高压液相色谱分析检测。
2细胞活力及凋亡检测:
(1)细胞培养
急性早幼粒细胞系HL60细胞,生长于含有10%热灭活胎牛
血清、12U/ml庆大霉素的RPNII1640培养液中,于370C.
5%CO2、饱和湿度的培养箱内传代培养。HL60细胞倍增时间为
20-22小时,所有实验均采用对数生长期细胞。
(2)细胞增殖测定:
分别用各种浓度分离产物及层析产物作用HL60细胞 1-72
小时,采用台盼蓝拒染法测定细胞活力。
(3)细胞凋亡形态学检测:
应用500ng/ml蟾蛛毒素分离提取物、层析纯化物及bufalin
分别作用HL60细胞2小时及5小时后,收集细胞并制成细胞涂
片,瑞f-姬姆萨染色,光学显微镜下观察细胞形态。
3细胞周期解析:
应用500ng/ml蟾赊毒素分离提取物、层析纯化物及bufalin
分别作用HL60细胞2小时及5小时后,收集细胞应用流式细胞
仪检测。
三统计学处理:所得数据用均值加减标准差,显著性检验采
用t检验,p0.05为差异显著。
结果
一 通过细胞活力检测,各种不同的蟾蛛毒素提取物及层析纯
化物对HL60细胞增殖抑制强度不同。其抑制作用从强到弱依次
为80%乙醇回流产物氯仿冷浸产物氯仿冷浸产物的层析产物
80%乙醇回流产物的层析产物,四种产物对HL60细胞抑制作
用均大于相同浓度的bufalina
二 蟾蛛毒素提取物可以诱导HL60细胞凋亡。应用500ng/nl
的乙醇分离提取物及其层析产物,氯仿提取物及其层析产物,
bufalin分别作用HL60细胞2小时及5小时。几种产物和bufalin
500ng/ml作用2小时后,细胞形态学及流式细胞仪检测均未发
现明显凋亡;作用5小时后,细胞形态学检测发现bufalin未能
诱导明显凋亡,乙醇分离提取物及其层析产物,氯仿提取物及其
层析产物作用后均观察到细胞明显凋亡。流式细胞仪解析发现除
bufalin作用后未见明显的细胞凋亡峰,乙醇提取物作用后细胞
已经几乎完全死亡,其余三种产物作用后均在GO/Gl二倍体峰
之前出现明显凋亡峰。
三反相高效液相分析。乙醇分离提取物的层析部分纯化物的
色谱图显示主要含有六种组分,其中第五个组分与Bufalin(蟾蛛
剥的保留时间重合,提示第五个组分中可能含有bufalin.
讨论
蟾酥中成分复杂,含有数十种组分,其中脂蟾毒配基、蟾毒
灵和华蟾毒精是含量较大的主要活性与毒性成分。大剂量服用时
容易产生中毒反应。在蟾酥中起抗肿瘤作用的主要是蟾毒内酷,
临床应用的一种注射液由于是水溶液,可能未能发挥蟾蛛毒素最
大的抗肿瘤效果。而其余临床应用的口服制剂均未将蟾酥相对纯
化。本实验中我下门利用对蟾蛛皮脂腺及耳后腺分泌物分离提取和
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本人在医药行业摸爬滚打10年,做过实验室QC,仪器公司售后技术支持工程师,擅长解答实验室仪器问题,现为一家制药企业仪器管理。
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