重组hIGFI工程菌发酵及产物纯化研究.pdfVIP

摘 要 胰‘岛素样生长因子一I(IGF-I)是一种多功能的细胞增殖调控因子。重 组人胰岛素样生长因子一I(rhlGF-I)是一种很有发展潜力与广阔临床应 用前景的药物，现代生物技术的发展为重组hIGF-I的大规模生产提供了 可能途径。 基因工程菌的发酵技术是基因工程药物大规模生产的必备技术。本研 究构建了重组hIGF-IZ程菌EcoliBL21(DE3)IpRSET-IGF，对该重组 工程菌的生长及产物的表达规律进行了探索，并在此基础上进行高密度 发酵的初步研究，菌体最终发酵密度达OD,,。值20，表达的重组蛋白占 菌体总蛋白的25.4%,初步形成了一套重组hIGF-I工程菌发酵的工艺。 重组hIGF-I在重组I程菌EcoliBL21(DE3)IpRSET-IGF中以包涵 体的形式表达。针对这一重组蛋白包涵体的洗涤、变性、复性以及最终 的分离纯化过程进行研究。冬验结果表明，洗涤的包涵体纯度可达67.8%; 8moUL尿素及1Ommol/LDTT可以使包涵体充分溶解。在复性过程中， 采用分步透析逐渐降低尿素浓度的方法，可以有效地提高复性的效率; 与此同时，在复性液中加入氧化型及还原型的谷肮昔肤有助于提高变性 蛋白质中二硫w的正确配对。复性后的蛋白质采用QSepheroseFF离子 交换层析分离，可获得有一定生物学活性和免疫抗原性的重组蛋白。质 谱分析目标蛋白分子量为 7.8KD，与天然结构 IGF-I蛋白分子一致;重 、 组蛋白的纯度为85.27%，回收率为23.49%.- 关键词 重组人胰岛素样生长因子一1J重组大肠杆菌;发酵;包涵体; 蛋白质复性;、蛋白质纯化’ 一2一 一 ~‘，‘，，， 一 一 一 Abstract Insulin-likegrowthfactorI(IGF-I)isamultifunctionalcellregulating factor.Recombinanthumaninsulin-likegrowthfactorI(rhIGF-I)appears promisingtobedevelopedasadruginthetreatmentofmanydiseases.Itis possibletoproduceitonalargescalebymeansofmodembiotechnology. Itisanindispensabletechnologyforthefermentationtoproducegene engineeringdrugsonalargescale.WeestablishedrecombinanthIGF-I engineeringbacteriaEscherichiacoltBL21(DE3)币RSET-IGF,observed itsgrowthandexploredtheurlesofrecombinantproteinexpression.Onthe baseofabovestudies,weprocessedthepilotstudyofhighdensity fermentation.Thefinalcelldensity(ODwo)reached20,andtherecombinant proteinexpressionlevelwas25.4%ofthetotalcellularprotein.Aseriesof preliminary fermentationtechnicsofrecombinanthIGF-Iengineering bacteriahadbeenformed. Similartomajorityoftheeukaryoticproteins,rhIGF-Iwasexpressedas inclusionbodiesinE.coli.Aseriesofpurificationsteps,includingcell breakage,inclusionbodywashing,inclusionbodysolubilization,protein renaturationandion-exchangechromatogr