胰岛素、瘦素对大鼠下丘脑NPY神经元大电导钙激活钾通道调节及机制.docVIP

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文  摘  要  下丘脑是神经-内分泌两大机能系统的结合点，在维持机体生命活动和内环境稳 态中起重要的作用。由脂肪细胞分泌的瘦素（leptin）与胰岛 β 细胞分泌的胰岛素 （insulin）在下丘脑的神经-内分泌反馈环路中起到将外周信号传入下丘脑的作用。它 们作用于下丘脑中枢，通过改变神经元的电兴奋性来调节某些特定的效应神经元，如 神经肽 Y （NPY）神经元的生理功能。大电导钙激活钾通道（large conductance calcium-activated potassium channels，BK 通道）是众多 K+通道中的一种, 在中枢神经 系统（CNS）中广泛分布于树突，轴突，突触末端，以及神经元胞体。在细胞发生动 作电位期间, 通道可以被膜的去极化和细胞内 Ca2+水平的增高所激活, 其直接效应是 产生快后超极化电位。因此, 通道的作用主要是使神经元动作电位的时程维持在正常 范围内, 使神经元放电频率减少，降低神经元的兴奋性，从而最终影响神经冲动的传 导以及神经递质的释放。通道功能特性的改变, 将对神经元的活动和脑的正常功能产 生重要影响。然而，下丘脑内 NPY 神经元散在分布的特点使得很难对单个神经元电 生理活动进行观察。为了研究这一类神经元的内在活动及其对 insulin 和 leptin 的电生 理反应，我们通过建立将形态学特征与免疫细胞化学技术相结合的方法来鉴定 NPY 神经元，并运用全细胞膜片钳技术，研究 insulin 和 leptin 对 BK 通道的作用及其机制。 第一部分 Insulin 对培养大鼠下丘脑 NPY 神经元 BK 通道的影响及机制 目的：NPY 神经元是下丘脑内调节摄食和能量代谢的主要效应细胞，大量研究已证 实，insulin 能够抑制 NPY 神经元的活性。BK 通道在调节神经细胞兴奋性上发挥了重 要作用。本实验通过研究 insulin 对 NPY 神经元 BK 通道的作用，探讨 insulin 调控这 类神经元兴奋性的电生理机制。 方法：（1）采用免疫细胞化学技术鉴定与摄食相关的 NPY 神经元；（2）结合形态学 II 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 特征，采用全细胞膜片钳技术及及记录后的再次鉴定比对，研究 insulin 对这类神经元 BK 通道的调节作用及其可能的信号通路。 结果：（1）NPY 神经元具有明显形态学特征，典型的 NPY 神经元细胞体较小，成三 角形或纺锤形，大部分具有 1-3 个细小的，不分枝的一级树突。 2）Insulin（0.1-30 nM） 浓度依赖性地增加 BK 电流。3 nM insulin 在膜电位为+20-+60 mV 时可使 BK 电流的 I-V 曲线显著上移，并且能够使 BK 通道的稳态激活曲线左移。（3）Insulin 对 BK 电 流的增大作用能够被其受体阻断剂以及磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3-k）阻断剂所抑制，而 不受丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）阻断剂的影响。 结论：Insulin 可浓度依赖性地增加 BK 通道电流，且这种作用是通过 IR 介导的 PI3-k 途径实现。 第二部分 Leptin 对培养大鼠下丘脑 NPY 神经元 BK 通道的影响及机制 目的：生理状态下，leptin 发挥着与 insulin 相似的功能，CNS 中 leptin 同样能够抑制 NPY 神经元的活性。本实验通过研究 leptin 对 NPY 神经元 BK 通道的作用，探讨 leptin 调控这类神经元兴奋性的电生理机制，观察 leptin 对 NPY 神经元 BK 通道的作用是否 与 insulin 类似。 方法：（1）采用免疫细胞化学技术鉴定 NPY 神经元；（2）结合形态学特征，采用全 细胞膜片钳技术及及记录后的再次鉴定比对，研究 leptin 对这类神经元 BK 通道的调 节作用及其信号通路。 结果：（1）Leptin 对 NPY 神经元 BK 通道的影响与 insulin 极其类似。Leptin（1.0-300 nM）浓度依赖性地增加 NPY 神经元 BK 电流。30 nM leptin 在膜电位为+20 mV-+60 mV 时可使 BK 电流的 I-V 曲线显著上移，而对通道的电压依赖的激活特性以及激活阈电 位没有影响。30 nM leptin 还能够使 BK 通道的稳态激活曲线左移，而对曲线斜率没 有显著影响。（2）leptin 受体（LEPR）-门神激酶 2（JAK2）-PI3-k 信号通路阻断剂能 够抑制 leptin 引起的 NPY 神经元 BK 电流的增大，而 MAPK 阻断剂则不产生影响。 III 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 结论：Lep