海马神经元雄激素膜受体定位及其快速作用.pdfVIP

目 录 中文摘要……………………………………………………………………l 英文摘要……………………………………………………………………4 英文缩写……………………………………………………………………7 研究论文海马神经元雄激素膜受体的定位及其快速作用 。前言···…·······……“”………………………．．””．．…一”一”……一·9 刖舌“”…“““……“”………………………”””“…””一”……“‘y 材料与方法……………………………………………………………10 结果………………………………………“·…………………一“”…16 附图…·····………··……·……………·……··………·····……一”．．一19 附表……………………………………………………………………25 讨{念…··……···……··…………………………····…………………·26 结{仑………………···…··……····…··……………………………一一30 参考文献……………………………………………………………………30 综述雄激素快速作用的非基因组效应研究进展………………………34 致谢…·…。…………………………………·…·………一…………………53 个人简历……………………………………………………………………54 中文摘要 海马神经元雄激素膜受体的定位及其快速作用 摘 要 目的：以原代培养海马神经元为研究对象，观察睾酮．牛血清白蛋白． 神经元细胞膜雄激素特异性结合位点(膜受体)的存在；研究睾酮对原代 培养海马神经元Ca2+和钙调蛋白(CaM)的快速作用，为海马神经元雄激 素膜受体介导的非基因组作用研究提供实验依据。 方法： 1、原代海马神经元培养、形态观察及鉴定：新生1d内SD大鼠乳鼠， 无菌条件下断头取脑，剥离海马，去除血管和软脑膜，剪碎海马组织，胰 养箱内孵育，培养24h内，更换培养基为含L一谷氨酰胺和2％B27的 元及其纯度。 2、海马神经元雄激素膜受体定位研究：取培养8～10天的原代海马 神经元，加入T-BSA．FITC370C作用15min，激光共聚焦显微镜下观察雄 激素复合物的亚细胞定位。BSA．FITC作为阴性对照组。另设竞争性实验， 素膜受体。 3、研究雄激素对海马神经元Ca2+的快速作用：Ca2+敏感荧光染料 T干预前后细胞内Ca2+的变化。每隔2s记录一次，共记录30min。 4、研究雄激素对海马神经元CaM的快速作用：应用免疫荧光细胞化 学技术观察10。7M CaM 的表达情况。 结果： 1、原代海马神经元培养，6～8h开始贴壁，培养24h后大部分神经 中文摘要 元贴壁并伸出突起，培养3d神经元突起增多并延长。随着培养时间延长， 胞体增大，丰满，突起进一步增粗延长，交织成网络。细胞呈多极神经元， 形态多样，有锥形、三角形、梭形、椭圆形等等。培养3w后，细胞开始 退化，胞质中出现颗粒空泡，突起退化、核固缩崩解。MTT法绘制生长 育成熟，之后处于达到平稳状态(11d～)。经NeuN免疫细胞化学染色， 经元胞膜上有特异性荧光，其神经突起起始部亦有荧光，而内部无特异性 标记。在同样孵育条件下BSA．FITC没有结合到神经元上。游离T预先孵 育几乎未检测到任何荧光染色，表明T预先孵育可以完全阻断 T-BSA—FITC膜结合作用。 3、雄激素对海马神经元Ca2+的快速作用研究结果：原代海马神经元 F1u04．AM钙探针负载，激光共聚焦显微镜下给予T处理，部分神经元在 给药后数分钟内细胞内钙有增高，并可诱发出细胞内钙波动，峰值较基础 值增高3．45士O．20倍，且峰值出现在给药后20min内。 4、雄激素对海马神经元CaM的快速作用研究结果：T干预各时间组 30min组(PO．05)。 结论： 1、出生24h以内的SD大鼠乳鼠，体外无血清培养技术可以成功培 养出原代海马神经元，经鉴定细胞纯度达到95％以上，培养8～10d可用 于实验。