p16真核表达载体构建及其转基因研究.pdfVIP

中文摘要 ku的蛋白质， 白时找到一个能有效地抑制CDK4活性、相对分子质量为16 经胶质瘤、肺癌、白血病中p16基因经常发生缺失、重排及转录水平表达的 丧失。目前p16研究主要集中在肿瘤发生中p16失活方式及作为抗肿瘤药 物研究等方面，在转基因动物水平的研究很少。我们构建p16真核表达载 携带人p16基因的转基因小鼠，可为将来在个体水平研究p16基因的功能 奠定基础。 本研究共分两部分，第一部分是p16真核表达载体的构建及其稳定表 达的NIH3T3细胞橼的建立；第二部分是用显微注射法制备携带人p16基 因的转基因小鼠。 第一部分p16真核表达载体的构建及其稳定表达的 NIH3T3细胞株的建立 实验目的 株，为应用显微注射法制备携带人p16基因的转基因小鼠奠定基础。 实验方法 质粒，将该重组质粒转化DH5a感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆，进行gcoR I和Xho I双酶切鉴定、DNA测序及生物信息学分析，将已鉴定的pCR@3． 中2个为lit-PCR阳性。 实验结果 中可以检测列p16mRNA的表达，且细胞生长速度受到明显的抑制 讨 论 大多数正常组织中，p16的正常表达水平极低。小鼠中只有一些成年 组织用RT—PCR才能检测到其表达。细胞倍增次数的增加和癌基因的导 人，可激活正常细胞中p16的表达，进而抑制细胞分裂，诱导细胞老化。 大，细胞生长阻滞于G，期，而注入肿瘤来源的变异p16蛋白不能抑制细胞 生长。将人正常细胞系换为p16““基因变异的瘤细胞系，亦出现相同的结 显微注射p16““的表达质粒，亦观察到细胞周期阻滞现象，但用CDK4或 CDK6表达质粒与p16““表达质粒共同注射，未出现明显的阻滞现象。本 结果一致。 INK4a／ARF基因位点通过基因重叠编码两种不同的蛋白质，二者都参 与衰老及肿瘤抑制过程，这两个基因有各自独立的启动子，产生不同的转录 为p14“’)，尽管具有共同的外显子2和3，但是，它们有不同的阅读框架， 因此，这两种蛋白质的氨基酸序列不具有同源性。敲除外显子113的小鼠 与敲除外显子2和3的小鼠在肿瘤易患性方面有惊人的相似之处，这说明 在小鼠肿瘤抑制方面，p19””具有更大的相关性，这也对p16…“是肿瘤抑制 得其稳定表达的NIH3T3细胞株，这为进一步利用受精卵原核显微注射法 或体细胞克隆法制备p16Ⅲ‰转基因小鼠，在活体水平研究p16Ⅲ‰基因的功 能打下基础。 ·2· 实验结论 1．成功构建了pCR@3．I／p16真核表达质粒。 mRNA表 了4个阳性细胞株，通过RT—PCR检测证明，其中2个有人p16 达。 3．人的p16基因真核表达质粒能显著抑制NIH3T3细胞的生长 第二部分用显微注射法制备携带人p16基因的转基因小鼠 实验目的 用显微注射法制备携带人p16基因的转基因小鼠。 实验方法 对204只近交系615小鼠进行超排卵，收集受精卵，将人p16基因真核 表达质粒pCR@3．1／p16显微注射到受精卵的原核内。将注射后成活且健 康的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管内，使其发育直至分娩。PCR分析检 测仔鼠基因组中转基因的整合。 实验结果 显微注射510个受精卵，其中成活且健康的350个，卵的成活率为68．6％。 将其移植到21只假孕母鼠的输卵管内，其中12只假孕母鼠怀孕，并产仔 46只，妊娠受体产仔率为22．4％，总产仔率13％。PCR分析45只仔鼠， PCR结果为阴性。