盘基网柄菌尿囊酸酶基因表达产物纯化及多克隆抗体制备.pdfVIP

盘基网柄菌尿囊酸酶基因表达产物的纯化及多克隆抗体制备 研究生：魏晓静 学 号：51051300046 专 业：动物学 研究方向：动物细胞与分子生物学 导 师：侯连生 摘 要 discoideum)是一种“土壤阿米巴一，以吞食细菌 盘基网柄菌(Dictyostelium 为生。在营养丰富条件下，以单细胞形式存在；一旦食物匮乏，单个细胞聚集成 多细胞体，细胞历经细胞丘、蛞蝓体、拔顶阶段完成发育和分化过程，最终形成 由孢子细胞和柄细胞组成的子实体，在合适条件下，孢子细胞萌发开始新生命周 期。由于其具有单细胞和多细胞的生命过程，生命现象丰富，作为非常好的模式 动物，用来研究细胞的运动性，细胞间的信号转导以及细胞类型的特化和细胞发 育等。 LagC基因编码的gpl50蛋白是一种膜蛋白，一种异嗜性细胞表面粘附分子， 通过细胞间异嗜性粘着的相互作用来调节细胞的粘着，以此来调节细胞的分化。 gpl50缺失的细胞株AKl27不能完成多细胞发育，发育只能停留在细胞松散聚 集阶段。由此推测，gpl50蛋白在盘基网柄菌发育过程中起着重要作用，它可能 参与介导细胞分化和凋亡的信号转导途径，但具体的信号通路至今仍未完全清 楚。为了研究gpl50对盘基网柄菌多细胞发育相关基因的影响，运用DDRT-PCR 方法发现在野生型细胞KAx．3和突变细胞AKl27发育到14小时，有一差异表 同源序列比对，该序列中98％的碱基与盘基网柄菌中尿囊酸酶基因(长度为 1100bp)部分片断几乎完全一致，E值为零，因此我们判断该基因在野生型细胞 株KAx．3和突变型细胞株AKl27在发育过程中存在差异表达。 2005年盘基网柄菌全基因组测序工作完成，全基因组由六条染色体，线粒 体DNA，以及核糖体DNA组成。allC基因位于第三号染色体上，编码的蛋白分 囊酸生成脲基乙醇酸，后者进一步降解为氨、二氧化碳和乙醛酸。而代谢过程中 产生的氨是一种盘基网柄菌发育调控中一种重要的信号分子，氨通过抑制诱导分 化因子(DIF)的累积来抑制柄细胞的发育并促进孢子细胞的形成。为此我们克 隆表达了尿囊酸酶基因，并制备多克隆抗体，为研究该基因在盘基网柄菌发育调 控中的功能提供依据。 本实验提取盘基网柄菌野生型细胞株KAx．3发育到14小时细胞的总RNA， 逆转录PCR得到cDNA第一链，以eDNA第一链为模板克隆出尿囊酸酶基因， discoideum)尿囊酸酶基因克隆入融合表达载体 将盘基网柄菌(Dictyostelium pET-32a，并在大肠杆菌E．eoliBL21(DE3)中进行诱导表达，结果获得较高纯度 的表达蛋白。表达菌株经lmmol／LIPTG诱导4h后，尿囊酸酶蛋白高效表达并 形成包涵体，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的37％。包涵体经8mol／L尿素 溶解后，经NI-NTA金属螯合层析柱在变性条件下纯化，得到纯度达70％的尿 囊酸酶融合蛋白。采用切胶回收的方法切割回收该融合蛋白，免疫新西兰大白兔， 制备和获得了多克隆抗血清。用westernblot检测该抗血清与融合尿囊酸酶免疫 反应，结果发现即便抗血清稀释到l：2000，也能与融合尿囊酸酶产生良好的识 别反应。因此本研究成功制备了尿囊酸酶多克隆抗体，为研究该基因在盘基网柄 菌发育过程的功能提供有力的工具，也为今后研究该基因与gpl50蛋白的关系提 供理论依据。 关键词：盘基网柄菌；尿囊酸酶；原核表达；蛋白纯化；多克隆抗体 ‘ 一 ， protonpurilication， polyclonalantibody ，proteinpurificatiq，polyclonal of from discoideum allantoicase(口盯 preparation