生物技术制药--基因工程制药.ppt

第三章 基因工程制药 本章主要内容 第一节 概述 第二节 基因工程药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的稳定性 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 第七节 基因工程菌发酵 第八节 基因工程药物的质量控制 第一节 概述 生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的应用是用于生物治疗的新型生物药物的研制。 之前，许多在疾病诊断、治疗和预防中有重要价值的内源性生理活性物质以及某些疫苗：由于材料来源困难或制造技术问题而无法研制出产品;应用传统技术从动物器官中提取，造价太高；因来源困难而供不应求；免疫抗原反应；病毒感染不安全。 利用基因工程技术生产药物的优点： 1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障； 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； 第二节 基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 基因工程的主要操作步骤 基因工程药物制造的主要程序 目的基因的克隆； 构建DNA重组体； 将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌； 工程菌的发酵； 外源基因表达产物的分离纯化； 产品的检验等。 通常将基因工程药物的生产分为上游和下游技术。 上游阶段是研究开发必不可少的基础，它主要是分离目的基因，构建工程菌，在实验室完成。 下游阶段是从工程菌的大规模培养到产品的分离纯化、质量控制，该阶段是将实验室成果产业化、商品化。 下游下工技术主要包括工程菌大规模培养最佳参数的确定、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制等。 第三节 目的基因的获得 对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因。 对于真核生物不能进行直接分离。 真核细胞中基因总量较大，从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。 另外，真核基因一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，真核基因转录的mRNA 也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA ，因此不能直接克隆真核基因。 内含子是基因内的间隔序列，不出现在成熟的RNA分子中，在转录后通过加工被切除。大多数真核生物的基因都有内含子。需注意的是，在古细菌中也有内含子。 　　在转录后的加工中，从最初的转录产物除去的内部的核苷酸序列。术语内含子也指编码相应RNA内含子的DNA中的区域。 　　大多数真核结构基因中的间插序列（intervening sequence）或不编码序列。它们可以转录，但在基因转录后，由这些间插序列转录的部分（也可用内含子这个术语表示）经加工被从初级转录本中准确除去，才产生有功能的RNA。基因的编码部分称外显子。内含子常比外显子长，且占基因的更大比例。真核基因所含内含子的数目、位置和长度不尽相同，如鸡卵清蛋白基因的外显子被7个内含子隔开，鸡卵伴清蛋白基因有17个内含子，α-珠蛋白基因有2个内含子，卵粘蛋白基因有6个内含子等。 　　又称沉默DNA（silent DNA）。真核基因中的非翻译区，它不被表达于蛋白质分子或成熟的mRNA中。内含子把单个真核基因分成许多不连续的区域。内含子也可见于某些前核基因组，但较为少见，且也有许多调节功能。由核RNA转录产生的为不均一核RNA(hnRNA)含有内含子，经特殊的酶（如ribozyme）作用切去内含子序列，然后剩余的外显子（exon）被连接酶拼接成为成熟的mRNA。 内含子和外显子 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA（cDNA），然后进行互补DNA的克隆表达。该序列不含内含子。 互补DNA克隆示意图 1、mRNA的纯化 细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难，但是mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸Oligo dT-纤维素上，从而可以用亲和层析法（高盐结合，低盐洗脱）将mRNA从细胞总RNA上分离，得到纯度较高的mRNA 2、互补DNA第一链的合成 mRNA的3末端常含有一多聚腺苷酸A序列，可用寡聚脱氧胸苷酸T为引物，在逆转录酶的催化下，开始互补DNA的合成。 放射性标记的dNTP检测合成效率，优化条件 3、互补DNA第二条链的合成 先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的mRNA链， 然后以互补DNA第一链为模板合成第二链，DNA聚合酶Ⅰ催化， 并用核酸酶S1专一性切除单链DNA。 4、互