第五章 分子生物学研究法(上).ppt

RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280 来判断。OD260为1时相当于浓度为40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/ OD280的比值将明显低于1.8。 由于RNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（cDNA，complementary DNA），再插入到可以自我复制的载体中。 图5-15 cDNA合成过程示意图。 图5-16 定向cDNA 合成及分子修饰 因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA- mcrB-菌株以防止cDNA被降解。 cDNA文库的构建 cDNA的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。 cDNA文库常用Uni-zap XR（一种λ噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有pBluescript载体的全部序列。 重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。 基因文库的筛选 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。 1、核酸杂交法： 核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。 将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。 取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变性。用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。 80℃烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平板上的位置找到相应克隆。 图 5-17 通过核酸杂交筛选目的克隆流程图 2、PCR筛选法 将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。 3、免疫筛选法 该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。 图5-18 噬菌体表达文库的免疫化学筛选法示意图 5. 4 SNP的理论与应用 SNP是Single Nucleotide Polymorphism的缩写，即单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A，T，C和G）的突变而引起的多态性。 SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。 5. 4. 1 SNP概述 科学上把染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点。SNP是基因组中最简单最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。SNP检测和分析技术已经成为继限制性片段长度多态性（RFLP）和微卫星标记（SSR）之后的第三代遗传标记。 染色体上共同遗传的SNP组合 图中SNP1和SNP2在同一条染色体上而且距离很近，SNP1有等位位点A和G，SNP2有等位位点G和T。因此，染色体对有两种可能的SNP组合。 T T T C C H60 H3 C C A T C B-1 C C A T C MO17 H2 T T A T T B-73 T T A T T E-2 T T A T T H-1 T T A T T H-3 T T A T T H-4 H1 236 232 165 130 57 内含子IV 外显子IV 基因型 单倍型 玉米globulin1不同单倍型和基因型之间的多态性比较 据估计，人类DNA中每300-1000个碱基对就有一个SNP，因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个SNPs。位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型（haplotype），相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。 根据SNP在基因组中的分布位置分为编码区SNP（cSNP），调控区SNP（pSNP）和非编码区SNP（rSNP）三类。 编码区内的变异率仅占周围序列的1/5，cSNP的总量显著少于其它两类SNPs。 cSNP分