Pin1抑制对Tau磷酸化的影响及其机制论文.docVIP

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Pin1 抑制对 Tau 蛋白磷酸化的影响及其机制  硕士研究生  王 丹 丽  导  师 摘  王建枝教授 要  Tau 蛋白是一种微管结合蛋白。过度磷酸化的 Tau，不但会丧失其正常的结合并组 装微管的功能，而且还是阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD) 的特征性病理改变之 一,神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)的主要组成成分。 Pin1 是微小菌素样多肽脯氨酸顺反式异构酶(Parvulin-Like Peptidyl Prolyl cis/trans Isomerases，PpIase)的一种，其基因序列高度保守,作用底物非常广泛。Pin1 与底物蛋白 结合后，可使其发生顺反式构象的改变，继而影响底物的稳定性、活性、磷酸化状态、 亚细胞定位，以及与其他蛋白质之间的相互作用关系。例如，Pin1 可以识别并结合磷酸 化的 Tau 蛋白上 pThr212-Pro213 和 pThr231-Pro232 位点，继而异构磷酸化的 Tau 蛋白, 使其构象由顺式变为反式，从而有利与它被磷酸酯酶 PP2A 识别，去磷酸化并恢复正常 的微管结合功能。但是，研究表明，在 AD 脑中,尤其是海马组织中，Pin1 的含量和活性 都是明显下降的。 Juglone,即 5-羟基-1，4-萘醌，中文名胡桃醌，提取自胡桃壳(Walnut Hulls)。早在 1998 年，juglone 首次被发现能够抑制和减少包括人类的 Pin1 在内的某些微小菌素样多 肽脯氨酸顺反式异构酶(Parvulin-Like Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerases，PpIase)的活性 和含量。之后，许多人开始在动物活体上使用 juglone 作为 Pin1 的抑制剂来进行科研。 在我们的实验中，为研究异常降低的 Pin1 造成的影响，我们在动物和细胞中使用 Pin1 的抑制剂 juglone，模拟 AD 病人脑中 Pin1 降低的状态，并观察其对大鼠学习和记 忆能力的影响，以及伴发的蛋白分子改变情况。 结果：1.我们经水源持续 5 周给大鼠不同浓度的 juglone 构建慢性动物模型，检测其 行为学改变，发现给药大鼠表现出剂量依赖的学习和记忆能力下降。而且给药之后，在 Pin1 减少的同时，非磷酸化的 Tau 减少，Tau 蛋白上 Thr231 位点的磷酸化程度明显增 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 强。 2. 行双侧脑海马立体定位注射术，将不同浓度的 juglone 定位注射到大鼠海马，以 构建急性动物模型。术后，检测其 Tau 蛋白磷酸化水平，结果与慢性动物模型组一致。 3. 离体水平，在不同梯度 juglone 处理过的 N2a/wt 细胞中，亦发现 Pin1 减少，伴 有 Tau 的磷酸化程度增强。 已有研究表明，Tau 蛋白的 Thr231 位点的磷酸化状态对 Tau 蛋白微管结合能力影 响很大。而 Thr231 位点正是糖原合成激酶 3(GSK-3)β 亚基作用于 Tau 的靶点之一。所 以，我们就研究了上述给药动物和细胞中 GSK-3β 的改变情况，以探究它在 juglone 所 导致的 Tau 过度磷酸化中扮演的角色。 结果：1.急性和慢性造模大鼠的各个给药组出现 Pin1 不同程度的下降，同时，非激 活形式的 GSK-3β 减少，而激活形式的 GSK-3β 则在较大剂量(100uM) juglone 时明显增 多。 2. 经不同浓度 juglone 处理过的 N2a/wt 细胞，发现非激活形式的 GSK-3β 水平随 给药浓度的升高而下降，激活形式的 GSK-3β 的水平随给药浓度的升高而升高。 之前，我们实验室研究发现 GSK-3β 可抑制海马长时程增强。而且有许多实验都证 明，激活 GSK-3β 可以损伤大鼠的学习和记忆能力。再结合本次实验结果，我们得到以 下结论： 1．在大鼠上，用 juglone 抑制 Pin1 会导致 GSK-3β 过度激活。 2．Pin1 蛋白的减少可能通过过度激活 GSK-3β 引起 Tau 蛋白过度磷酸化。 3．Pin1 蛋白的减少可能通过过度激活 GSK-3β 损害了大鼠的学习和记忆。 关键词：阿尔茨海默病 胡桃醌 糖原合成激酶 3 Pin1 Tau 2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Effect of Pin1 inhibition on Tau phosphorylation and its underlying mechanisms  Postgraduate: Supervisor:  Wang Danli