猪CuZnSOD基因的克隆、mRNA表达及其对肉质抗氧化性能的影响论文.docVIP

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 随着现代饲养业集约化程度的不断提高，氧化在商品猪生产中的危害已大量显现， 可负面影响活体动物的免疫机能和宰后肉质特性等。抗氧化酶可缓解或者抑制自由基的 负面效应，提高商品猪的抗氧化能力,进而改善商品猪的肉质。CuZnSOD(Copper Zinc Superoxide Dismutase)是超氧化物歧化酶(SODs)家族的成员之一，是集体防御氧化损伤 的一种重要的金属酶，能转移性地清除超氧阴离子自由基，在维持氧自由基平衡方面起 着重要的作用。 为了进一步了解和认识 CuZnSOD 基因的结构和功能，揭示 CuZnSOD 对猪抗氧化 机能的影响，寻找与肉质性状相关联的分子标记。本研究采用 RACE(Rapid Amplification of cDNA End)和 Genome Walking 的方法，对莱芜猪 CuZnSOD 基因 cDNA 和启动子区域 进行克隆测序，分析基因结构和功能，并构建能在细胞中表达的真核表达载体。用 QRT-PCR 检测 CuZnSOD 基因的品种和组织差异表达，研究其表达对肉质性状和肉质抗 氧化的影响。本研究主要分以下三个部分： 1. CuZnSOD 基因 cDNA 序列全长 658 bp(GenBank 登录号: GU944822)，包含 76 bp 的 5′ UTR 和 120 bp 的 3′ UTR 序列。全部 CDS 序列 462 bp，编码 153 个氨基酸，分子 量为 15.9 kDa，等电点 PI 为 6.03。采用 Genome Walking 试剂盒扩增基因组的启动子序 列，扩增得到 1876bp 的片段。CuZnSOD 基因编码的氨基酸序列中，第 3 氨基酸残基处 存在 1 个 O-糖基化位点，第 86 氨基酸残基处存在 1 个 N-糖基化位点。二级结构中 α 螺 旋仅占 1.31%。在进化过程中高度保守，与人、牛、小鼠和大鼠的编码区同源性分别为 87.74%、87.66%、83.44%和 83.23%；氨基酸序列同源性分别为 90.26%、94.12%、92.21% 和 91.50%。基于蛋白序列所构建的分子进化树，表明猪与牛的亲缘关系最近。 2. 采用 RT-PCR 方法，以莱芜猪肌肉总 RNA 为模板扩增 CuZnSOD 基因的全长 cDNA 编码区序列，采用 TA 克隆技术，将目的片段插入到 pUCm-T 载体中进行鉴定， 重组的质粒命名为 pUCm-T-CuZnSOD。随后将 CuZnSOD 进一步克隆到真核表达载体 pcDNA3.1(+)中。用脂质体将经过测序、验证的重组 pcDNA3.1(+)/CuZnSOD 质粒转染 到山羊毛囊外根鞘细胞中，用 QRT-PCR 检测 CuZnSOD 基因 mRNA 的表达。结果：成 功构建了 pcDNA3.1(+)/CuZnSOD 真核表达质粒，转染山羊毛囊外根鞘细胞， QRT-PCR 检测结果表明，所转染的 CuZnSOD 在山羊毛囊外根鞘细胞中成功表达。成功构建真核 表达质粒 pcDNA3.1(+)/CuZnSOD，为进一步研究 CuZnSOD 在肉质抗氧化的作用中奠 1 猪 CuZnSOD 基因的克隆、mRNA 表达及其对肉质抗氧化性能的影响 定了基础。 3. 在 mRNA 水平上，CuZnSOD 是一个广谱表达基因，在大脑、心脏、脾脏、肝脏、 肾脏、肺、大肠、小肠、脊髓、肌肉、背膘和胃中都能检测到，同一个品种内 CuZnSOD 基因 mRNA 的表达存在明显的组织差异（P0.05），其在肾脏、小肠和肺中表达量较高， 在心脏和肌肉组织中表达量较低。在肌肉、背膘和肝脏三种组织中 CuZnSOD 基因 mRNA 的表达存在明显的品种差异（P0.05），并且 CuZnSOD 基因 mRNA 的表达始终是莱芜 猪＞鲁莱黑猪＞大约克夏猪。CuZnSOD mRNA 表达越高，SOD 活性越高，MDA 含量 越低，肌肉的系水力越高、肉色越鲜艳，并且肉质越细嫩。 关键词：猪；CuZnSOD；基因克隆；表达分析；QRT-PCR；抗氧化；肉质特性 2 山东农业大学硕士学位论文 Study on Cloning and Expression of Porcine CuZnSOD Gene and Their Relationship with Anti-oxidative Capacity and Pork Quality Abstract With the development of intensive modern husbandry, oxidations in the production of commercial pigs have appeared to be harmful of th