蛋白激酶CK2α特异性siRNA真核表达载体的构建及其对喉癌抑制作用的实验研究.docVIP

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 蛋白激酶 CK2特异性 siRNA 真核表达载体的构建 及其对喉癌抑制作用的实验研究 博士研究生： 王建亭  导  师：  龚树生 教授  中文摘要 第一部分 蛋白激酶 CK2在喉癌细胞 Hep-2 及喉鳞状细胞癌组织中表达  实验一  蛋白激酶 CK2在喉癌细胞 Hep-2 中的表达  目的：研究蛋白激酶 CK2(Protein kinase CK2ɑ)在人喉癌细胞 Hep－2 中的表 达，探讨其与喉癌细胞之间的关系。 方法：体外培养 Hep-2 和 Hacat 细胞，应用逆转录-聚合酶链反应（RT－PCR）技 术分别检测蛋白激酶 CK2 mRNA 在 Hep-2 细胞和 Hacat 细胞中的表达；应用免疫细 胞化学技术分别检测蛋白激酶 CK2蛋白在 Hep-2 细胞和 Hacat 细胞中的表达。 结果：蛋白激酶 CK2 mRNA 在 Hep-2 细胞中高表达，在 Hacat 细胞中低表达， 差异有统计学意义（P 0.01）。蛋白激酶 CK2蛋白在 Hep-2 细胞中高表达，在 Hacat 细胞中低表达，差异有统计学意义（P 0.05）。 结论：蛋白激酶 CK2过表达可能与喉癌的发生和发展有关。 关键词：蛋白激酶 CK2；喉肿瘤；Hep－2 细胞；免疫细胞化学  实验二  蛋白激酶 CK2在喉鳞状细胞癌组织中的表达  目的：研究蛋白激酶 CK2在喉鳞状细胞癌（LSCC）组织中的表达及临床意义。 方法：应用免疫组织化学 SP 法检测 50 例 LSCC 组织及 10 例正常喉黏膜组织中 蛋白激酶 CK2蛋白的表达情况，并采用图像分析系统对表达结果进行定量分析。 1 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 结果：蛋白激酶 CK2蛋白在 LSCC 组织中阳性表达率为 64.00％（32/50）,在正 常喉黏膜组织中阳性表达率为 30.00％（3/10）。喉癌组和对照组之间蛋白激酶 CK2 阳性表达的平均吸光度值差异有统计学意义（P﹤0.01）, 喉癌组织中蛋白激酶 CK2 阳性表达的平均吸光度值与患者年龄、性别、临床分型（肿瘤部位）、临床 TNM 分期 和淋巴结转移均无统计学意义 ,和病理分级 (G1→ G2+G3)有高度显著相关性（ P﹤ 0.01）。 结论：蛋白激酶 CK2过表达可能与 LSCC 的发生、发展有关，检测蛋白激酶 CK2 可作为判定 LSCC 恶性程度的潜在指标之一，抗蛋白激酶 CK2可能为喉癌治疗提供 一个新途径。 关键词：蛋白激酶 CK2；喉肿瘤；鳞状细胞癌；免疫组织化学 第二部分 蛋白激酶 CK2特异性 siRNA 真核表达载体的构建 及其对喉癌细胞 Hep-2 生长及侵袭的抑制作用 目的：研究蛋白激酶 CK2特异性 siRNA 对人喉癌细胞 Hep-2 增殖、凋亡和侵袭的 影响。 方法：构建蛋白激酶 CK2特异性 siRNA 表达质粒 psiRNA-hH1neo-CK2 及非特异性 表达质粒 psiRNA-hH1neo-cont，分别用脂质体转染法转染 Hep-2 细胞。采用逆转录聚 合酶链反应、Western Blot 技术检测转染后 Hep-2 细胞蛋白激酶 CK2 mRNA 和蛋白表 达，采用 MTT 法检测转染后 Hep-2 细胞的增殖情况, 采用流式细胞术检测转染后对 Hep-2 细胞凋亡的影响，采用 Boyden 小室侵袭实验检测转染后 Hep－2 细胞侵袭力的 变化。 结 果 ： 成 功 构 建 蛋 白 激 酶 CK2 特 异 性 siRNA 真 核 表 达 载 体 。 转 染 psiRNA-hH1neo-CK2 载体后，Hep-2 细胞蛋白激酶 CK2 mRNA 和蛋白表达均较非特异 干扰组和空白组明显下降（P﹤0.05）,并且生长缓慢,细胞周期出现明显亚二倍体峰， Hep－2 细胞侵袭力明显减弱（P﹤0.01）。 结论：蛋白激酶 CK2特异性 siRNA 表达载体可以抑制 Hep-2 细胞增殖和侵袭并诱 2 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 导其凋亡。 关键词：喉肿瘤；癌，鳞状细胞；蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶；逆转录聚合酶链反 应；RNA 干扰,肿瘤侵袭 第三部分 蛋白激酶 CK2ɑ特异性 siRNA 对人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用 目的：研究蛋白激酶 CK2ɑ特异性 siRNA 对喉癌 Hep-2 细胞裸鼠移植瘤生长和蛋白 激酶 CK2ɑ表达的影响 方法：裸鼠皮下种植人喉癌 Hep-2 细胞，肿瘤长到一定大小时，在肿瘤局部注射 蛋白激酶 CK2ɑ特异性 siRNA 表达质粒，观察肿瘤生长情况，应用逆转录-聚合酶链反 应（RT－PCR）检测蛋白激酶 CK2ɑ mRNA 在肿瘤中的表达，应用免疫