肺结核患者血清小分子标志蛋白分离鉴定初步研究.pdf

肺结核患者血清小分子标志蛋白 分离鉴定的初步研究 摘要 染患者和300万患者死亡，表明TB仍是影响全球人类健康的一个严重传染 病。然而目前结核的诊断技术不够理想，寻找快速、简便、灵敏度和特异 度高的结核杆菌的检测方法，对结核病的预防和控制有着重大的意义。 年来建立的筛选血清标志蛋白的蛋白质组学研究方法，具有高通量及高灵 敏度，目前已用于多种肿瘤标志物检测的研究。本研究前期工作已经从肺 结核患者和正常人血清中筛选出6个最具有诊断意义的肺结核血清标志蛋 白。利用这6个标志蛋白建立诊断模型，区分TB与正常对照的分类准确率 但由于SELDI技术尚不能直接鉴定出标志蛋白的序列，只能得出其分子量 信息。因此，本研究目的是应用各种技术分离鉴定这些肺结核血清标志蛋 白。 目的： 1、通过改进样品处理、电泳条件、染色方法等，提高小分子蛋白(10kD) 在一维SDS—PAGE上的分辨率，以达到质谱鉴定的要求。 方法进一步分离、鉴定前期SELDI已筛选出来具有诊断价值的结核标志蛋 白，并进行生物信息学分析。 1 方法： Removal试剂 l、分别应用等电点沉淀法、乙腈沉淀法、Albumin／IgG 盒去除血清中的中高丰度蛋白，再分别进行电泳、蛋白浓度测定，观察白 蛋白的去除情况和目的蛋白的保留情况。 NuPAGE 三种一维凝胶电泳(1D)体系对处理过的血清样品中小分子蛋白的分 离效果，以及分离胶加入尿素、甘油，电压，染色方法等电泳条件的优化。 3、通过一维凝胶电泳发现、分离肺结核相关血清小分子标志蛋白，经 切胶酶解和高效液相色谱串联质谱鉴定目标蛋白，并进行生物信息学分析。 结果： 1、三种方法比较，乙腈沉淀法能在去除血清95％左右的高中丰度蛋白的 Removal试剂盒法都能去除血清大部分高丰度蛋白，使部分小分子蛋白得以 显现，后者能很特异地只去除占血清中蛋白总量75％以上的白蛋白和免疫球 蛋白。 的蛋白条带清晰可见；分离胶中加入甘油或尿素能改善小分子蛋白的分离 效果；银染的灵敏度远高于胶体考染和常规考染，但在本实验中并没有发 现新的条带。 等技术鉴定出分子量为8778Da结核标志蛋白很可能为Apolipoprotein A-II，序列覆盖率为21％，有3个不重复的肽段得到鉴定，结果较为可靠。 4、生物信息学分析发现，载脂蛋白AII是一个分泌蛋白，它的一条氨 pI=5．05，可能与目的蛋白8778Da的氨基酸序列相同。结核病的发生、发 I叮 展与脂质代谢方式密切相关，ApoA—II又与脂质代谢密不可分，ApoA—I 能为结核比较特异的标志物。 结论： 1、乙腈沉淀法能在去除血清绝大部分高中丰度蛋白的同时收获更多的 15kD以下的小分子量蛋白，适合于分离血清15kD以下的蛋白。 常规考染简便，且与质谱兼容较好。 3、质谱鉴定和生物信息学分析结果显示，通过单向SDS—PAGE电泳分 离出蛋白，切胶回收、酶解，最后用高效液相串联质谱鉴定目的蛋白这一 套技术路线可用于血清小分子低丰度蛋白的分离鉴定。 4、ApoA-II很可能是肺结核相关的血清标志物。 关键词：分离，高效液相色谱，小分子蛋白，乙腈沉淀法， Tric ine—SDS—PAGE，生物信息学 THE OF LOW RESEARCH MOLECULARMARKERPROTEINSFROM PULMONARYTUBERCULOSISSERI丁小江 Abstract