苹果山梨醇脱氢酶基因克隆及其组织和亚细胞定位.pdf

中文摘要 山梨醇是木本蔷微科植物光合产物和光合同化物运输的主要形式。山梨醇脱氢酶(Sorbitol 1’1．1．14)是苹果分解利用山梨醇的关键酶，在调仃库强和细胞代谢中具有重 dehydrogenase，EC 要作用，与苹果果实的发育及品质、产量密切相关，山梨醇脱氢酶在苹果组织和细胞中的分布和 皿细胞定位是了解山梨醇代谢问题的基础。 以新红星苹果(MalusDomesticaBorkh 氨基酸，其氨基酸和DNA的同源性分别为72％和58．8％。原核表达产物具有山梨醇脱氢酶催化 活性，表明克隆的基因产物为山梨醇脱氢酶。根据抗原决定簇预测分析和生物学软件序列比对结 dot 果，各选取一段编码区序列，原核表达产物作为抗原制备抗体。Proteinblot和Westernblot检 测结果表明制备的抗体具有较高的反应灵敏度和特异性，而且弼个抗体与两个原核表达的全长蛋 片(源器官)中都有山梨醇脱氢酶的转录和翻译产物。 利用免疫组织化学技术对苹果不同器官中山梨醇脱氢酶的分布情况进行了研究。发现苹果果 实内山梨醇脱氢酶在维管组织(除导管分子外)和果肉细胞中都有分布。未完全展开的叶片内山 梨醇脱氢酶主要分布在维管组织内，叶肉组织中基本没有此酶分布。已经伸展开的幼叶以及成熟 叶片中维管组织和叶肉组织内都有山梨醇脱氢酶存在。 为了进一步确定山梨醇脱氢酶在不同组织细胞内的亚细胞定付情况，应用Westernblot和胶 体金免疫电镜定位技术进行了研究。在苹果果肉细胞、维管薄壁细胞、伴胞等细胞内山梨醇脱氢 酶主要位于细胞质内以及叫‘绿体中除淀粉粒之外的空间，在质膜、细胞壁以及线粒体、内质网等 细胞器上则基本没有此酶的分布，并且伴随着苹果果实的发育，山梨醇脱氢酶的量增加。成熟叶 片中山梨醇脱氢酶优先分布在叶绿体中淀粉粒之外的空间，细胞质内相对较少；在幼叶内则主要 分布在细胞质内，叶绿体上相对较少，并且在液泡内的电子致密物上也有山梨醇脱氢酶的分布。 在种子子叶细胞内山梨醇脱氢酶主要分布在粗面内质网的膜、粗面内质网腔、内质网断裂形成的 小泡内以及蛋白质储存泡内。 对山梨醇脱氢酶在不同发育时期、不同组织器官的分布和弧细胞定位的研究结果表明苹果中 山梨醇脱氢酶为一遍在蛋白，在苹果内广泛分布，但在不同组织器官内的作用位点存在差异，表 明不同部位山梨醇的代谢位点和方式不同，为研究山梨醇脱氢酶的分子和细胞学机制，以及为进 一步研究山梨醇在不同组织器官、不同发育时期的生物学功能提供了理论基础和实验依据。 Abstract is main InRosaccaesorbitolthe and plants primaryphotosyntheticproduct leavestosink sorbitol translocatedfrom tissues．NAD+-dependent of is the roleinsorbitolmetabolism DomesticaBorkh)，which 1．1．1．14)playskey apple(Malus ofsorbitolto ondistributionandsubcellular fortheoxidation fructose．So，thestudy responsible J localizationofsorbitol indifferent andtheir