新型KRAB型锌指蛋白ZNF569对MAPK信号通路的抑制作用.pptVIP

新型KRAB型锌指蛋白ZNF569对MAPK信号通路的抑制作用 背景 C2H2型锌指蛋白（KRAB-ZFP）是预测转录调节因子的最大家族中的成员。其结构特征是无指结构域的前后两锌指结构之间存在一连接序列 ”TGEKPYX” （H-Clink）。 ZNF569编码一个由686个氨基酸组成的预测蛋白。 该蛋白质在进化中是高度保守的。细胞中ZNF569的过表达会抑制SRE(血清反应元件)和AP-1（激活蛋白-1）的转录活性，而由siRNA引起的ZNF569的失活会使这种抑制作用丧失。 AP-1复合体是由转录因子构成的二聚体,可以被磷酸化的MAPK迅速的激活。MAPK家族是一种重要的信号转导介质，转录因子可以通过激活MAPKs中ERK（细胞外信号调节激酶）亚家族诱导AP-1。MAPKs通过与SRE（即血清反应元件）结合调节转录立即早期基因的表达。 KRAB和ZNF基序是ZNF569的有效抑制结构域。结果显示，ZNF569可能是MAPK信号通路中一种新型的抑制剂。 材料与方法 ZNF569的鉴别和序列分析（全长cDNA克隆与生物信息学分析 ） 人类成体和胚胎的ZNF569表达的Northern分析 瞬时转染及亚细胞定位分析 瞬时表达报告基因含量检测 RNA干扰分析 缺失分析 运用BLAST程序利用KRAB中的共有序列寻找人类EST数据库。 以心脏cDNA文库为模板进行PCR ↓ 琼脂糖凝胶电泳形成条带 ↓ 条带克隆入pMD18T-vector ↓ 随机克隆 ↓ 对获得序列进行同源性检索 ZNF569的基因组定位和基因组结构。 外显子用红色框来表示 ZNF569基因的外显子和内含子的长度及剪切位点。 不变的核苷酸(gt/ag)用粗体铅字强调。 对人类成体和胚胎组织ZNF569的Northern blot分析 COS-7细胞中ZNF569蛋白的亚细胞定位。图A表示EGFP-ZNF569在COS-7细胞中表达；图B表示细胞核用DAPI染色；图C是当ZNF569过表达时，ZNF569在COS-7细胞中的亚细胞定位(图A和图B形成的结合图)。 ZNF569的过表达解除其对AP-1-Luc转录活性的抑制作用 ZNF569的过表达会解除其对SRE-Luc转录活性的抑制作用 总结 ZNF569是一种新型的KRAB型锌指蛋白,从人类胚胎心脏cDNA文库中分离出来.它在不同种群的进化过程中是高度保守的。 ZNF569是一种转录抑制物。KRAB和ZNF结构是ZNF569的有效抑制结构域。当ZNF569与 Gal-4 的DNA结合域结合，并与VP-16发生共转染时，ZNF569就会抑制SRE和AP-1的转录活性。 ZNF569过表达会解除其对SRE和AP-1转录活性的抑制作用，原因可能是siRNA的存在。 ZNF569可能作为转录抑制因子通过抑制MAPK信号通路来调节多种细胞功能 KRAB是一种在进化上相较于锌指重复序列更保守的蛋白结构域 。对ZNF569中KRAB结构域序列的分析显示，与其他锌指蛋白相比，KRAB结构域有高度的同源性。 ZNF569可能通过KRAB结构域和锌指结构域与其他转录因子和调节子结合，从而形成哺乳动物介导复合物。 关于这种新型转录抑制物的详细结构还需进一步进行研究。 * * 确认EST数据库中的cDNA序列 用于5’RACE 扩增ZNF569 ZNF569的cDNA全长为2061bp KRAB结构域 18个C2H2锌指结构 成人组织 25周胚胎 P32标记的ZNF569cDNA探针 Northern blot 多组织膜杂交 膜形成条带状 并用作为mRNA含量指示剂的放射性标记的β-肌动蛋白cDNA进行检测 成体 胚胎 EGFP-ZNF569 定位在COS-7细胞的细胞核中 pCMV-BD–ZNF569或pCMV-BD与pL8G5-Luc reporter和pLexA-VP16短暂地共转染到COS-7细胞中。 *