第二章植物基因克隆的工具酶2.pptVIP

第二节 DNA连接酶（DNA ligase） 两种DNA连接酶的比较 四、影响连接反应的因素 1、DNA浓度： 插入片段：载体分子的摩尔比=3：1较好，一般在2-20 nmol/L 2、反应时间与温度： 温度一般在4-16℃间，常用12℃-16℃30min-16h 黏末端：20℃，30min；20℃，60min（有氢键） 平末端：可使用较高温度（无氢键） 四、影响连接反应的因素 3、连接酶的用量： 粘末端：0.1 U/μg DNA 平末端：1-2 U/μg DNA 4、其他干扰因素如EDTA、杂蛋白质、存留有活性的酶等影响酶切的因素也影响连接效果。 5、ATP浓度：最适0.5mmol-1mmol/L 第三节 DNA聚合酶（ DNA polymerase ） 第四节 核酸酶 通常所用的Klenow片段是由枯草杆菌蛋白酶切割完整的DNA聚合酶片段而成，或是经过克隆产生的一条多肽链(Mr=76 kDa)。 ? Klenow 片段 1、Klenow 片段的由来 ? Klenow 片段 1、Klenow 片段的由来 E. coli DNA pol Ⅰ 蛋白酶 较小片段 较大片段 (Klenow片段) 5′ 3′ 3′ 5′ 聚 外 合 切 酶 酶 活 活 性 性 性质 5′ 3′外切酶活性 ? Klenow 片段 2、Klenow 片段的用途 填补由DNA限制酶反应产生的凹陷3′末端。 DNA分子的末端标记。 在cDNA克隆出来后，合成cDNA第二条链。 用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA序列分 析等。 ① 3’端补平 5’ 5’ klenow ② DNA 3’末端标记 补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。 在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 klenow 主要用途 3’隐蔽末端的DNA片断 Klenow fragment补平 根据末端的顺序选择一种 ?-32P-dNTPs 末端标记的DNA 限制性内切酶切 5’----G3’ 3’----CTTAA5’ 5’----GAA3’ 3’----CTTAA5’ 5’----GAATT3’ 3’----CTTAA5’ 5’----G3’ 3’----CCTAG5’ 5’----GG3’ 3’----CCTAG5’ 5’----GGATC3’ 3’----CCTAG5’ EcoR I BamH I ?-32P-dATP ?-32P-dGTP 25oC 1h ③ cDNA第二链的合成 mRNA cDNA第一链 逆转录 cDNA第二链 klenow 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 引物 ? T4 DNA聚合酶 1、T4 DNA聚合酶的性质 T4 DNA聚合酶的外切酶活性 比Klenow片段高100~1000倍 与Klenow片段不同 具有5′ 3′聚合酶活性 具有3′ 5′外切酶活性 与Klenow片段相同 不具有5′ 3′外切酶活性 ? T4 DNA聚合酶 2、T4 DNA聚合酶的用途 填补或标记由限制酶切割DNA后产生的凹陷3′末端，标记反应时需要高浓度的dNTP，以保证聚合反应（填补）大于3′ 5′核酸外切酶活性。 进行3′突出末端的DNA末端标记。 ? T4DNA聚合酶 2、T4 DNA聚合酶的用途 标记用作杂交探针的DNA片段。 由3′ 5′核酸外切酶活性部分酶切双链DNA，得到凹缺3′末端用[32P]dNTP填补（取代合成）。 将双链DNA的末端转化成平头末端。 利用T4DNA聚合酶的3′ 5′核酸外切酶活性从双链DNA上切除突出3′末端，在高浓度dNTP中模板上双链区的降解与合成达到平衡。 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ T4 DNA聚合酶 无dNTPs T4 DNA聚合酶 有dNTPs 5’ 5’ 酶切中间产生两个末端标记 加入某种32P-dNTP和dNTPs T4 DNA聚合酶 （3’?5’外切） DNA酶切片断 T4 DNA聚合酶 （5’?3’聚合） 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 内切酶切 无dNTPs ? T7 噬菌体 DNA 聚合酶 来源： T7噬菌体感染的E. coli 结构：由2个蛋白亚基组成：T7噬菌体基因5编码的蛋白和宿主细胞的硫氧还蛋白 活性：① 5′→3′聚合，在所有DNA聚合酶中持续反应时间最长，所以合成的DNA链较长，在DNA测序中有很大优越性； ② 3′→5′外切活性（由