酶催化反应的特点.ppt

核酶（ribozyme）主要指一类具有催化功能的RNA，亦称RNA催化剂。 1982年，Cech等研究原生动物四膜虫rRNA时，首次发现rRNA基因转录产物的I型内含子剪切和外显子拼接过程可在无任何蛋白质存在的情况下发生，证明了RNA具有催化功能。 核酶的发现，从根本上改变了以往只有蛋白质才具有催化功能的概念 。 辅酶与辅基的异同点: 它们都是小分子物质，结构上常与维生素和核苷酸有关。但是辅酶与酶蛋白结合不紧，容易经透析除去，而辅基通常与酶蛋白共价相连。 金属离子的作用：它们是酶和底物联系的“桥梁”；稳定酶蛋白的构象；酶的“活性中心”的部分。 酶蛋白的作用：与特定的底物结合，决定反应的专一性。 辅酶、辅基的作用：参与电子的传递、基团的转移等，决定了酶所催化反应的性质。 结合酶举例： 乳酸脱氢酶（辅酶I， NAD） 异柠檬酸脱氢酶（辅酶I，NAD） 醇脱氢酶（辅酶I， NAD） 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（辅酶II, NADP） 琥珀酸脱氢酶（FAD） 乙酰辅酶A羧化酶（生物素，ATP，Mg++） 脂酰辅酶A合成酶（辅酶A, CoA） 4.如果一种酶可以催化几种底物发生反应，必然对每一种底物，各有一个特定的Km值，其中Km值最小的底物是该酶的最适底物 。 5.计算底物浓度和相对速度 例：试求酶反应速度达到最大反应速度的90％时，所需求的底物浓度（用Km表示）。 有机小分子： 一些还原剂，如抗坏血酸、半胱氨酸，使含-SH的酶处于还原态 金属螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)，可络合一些重金属杂质，解除它们对酶的抑制，从而使酶活升高。 酶的种类繁多，性质各异，分离纯化方法不尽相同，即便是同一种酶，也因其来源不同、酶的用途不同，而使分离纯化的步骤不一样。由于酶很不稳定，在提取时容易变性失活，因而提取酶时应注意： (1)温度。整个提纯操作应尽可能在低温下(0～4℃)进行，以防止蛋白水解酶对目的酶的破坏作用(尤其是在有机溶剂或无机盐存在下更应注意)。 (2)pH值。在提纯过程中一般采用缓冲液作为溶剂，防止过酸或过碱。对一特定的酶，溶剂pH值的选择应考虑酶的pH稳定性以及酶的溶解度。 (3)盐浓度。因为大多数蛋白质具有盐溶性质，所以在提取过程中可选用合适浓度的盐溶液以促进蛋白质溶解。但当盐浓度过高时，酶容易变性。 (4)搅拌。剧烈搅拌容易引起蛋白质变性，提纯应避免剧烈搅拌和产生泡沫。 (5)酶液是微生物生长的良好培养基，在提纯过程中应尽可能防止微生物对酶的破坏。 The end 五、酶的活力测定和分离纯化 ◇ （一）酶活力的测定 ◇ （二）酶的分离和纯化 （一）酶活力的测定 ◇ 1.酶活力 ◇ 2.酶的活力单位 ◇ 3.酶的比活力 ◇ 4.酶活力的测定方法 1.酶活力 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。 酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的速率来表示。反应速率越大，酶活力越高，反之，酶活力越低。 反应速率 单位时间内底物的减少量和产物的生成量。 初速度 反应开始时，酶反应速度不变时的速度。 2.酶的活力单位 酶活力单位：一般用活力单位U(Unit)表示，许多酶活力单位都是以最佳条件或某一固定条件下每分钟催化生成一微摩尔产物所需要的酶量为一个酶活力单位。 在最适的反应条件（25℃）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即： 1IU=1μmol/min 在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s 1kat = 6×107IU 3.酶的比活力 酶的比活力：是指每毫克酶蛋白所含有的酶活力单位数，它是酶制剂纯度的一个指标。 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白（氮） 酶的收率：指纯化过程中酶活性的收率。 4.酶活力的测定方法 （1）分光光度法 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。简便、迅速、准确。 （2）荧光法 该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。 （3）同位素测定法 （4）电化学法 有离子选择性电极法、微电子电位法、电流法等。 （二）酶的分离和纯化 ◇ 1.选材 ◇ 2.破碎 ◇ 3.抽提 ◇ 4.分离及纯化 ◇ 5.结晶 ◇ 6.保存 1.选材 选择酶含量丰富的新鲜生物材料，一种酶含量丰富的器官或组织往往和含量较低的器官或组织相差上千倍或上万倍。目前常用微生物为材料制备各种酶制剂。 酶的提取工作应在获得材料后