九州虫草无性型鉴定暨虫草属分子系统学及虫草素与DNA直接作用机理研究.pdf

山东大学博士论文 九州虫草无性型鉴定暨虫草属分子系统学及虫草素与 DNA直接作用的机理研究 中文 摘 要 虫草属C〔ordyceps(Fr.)Link〕真菌是一大类昆虫病原真菌，仅清水大典就己记载 316种。亦有报道，虫草属真菌迄今有记载达350余种。绝大多数为虫生真菌，在我国分 布的有70多种。生活史分为有性型和无性型阶段即世代交替现象。虫草菌寄生昆虫幼体 而形成的虫草亦即其有性型阶段有30多种，其中最珍贵的，也是目前广泛药用的我国特 产于青川滇藏3000-5000米高原地区的冬虫夏草(。叻cepssinensis).在分类学上，分类 学家把有性型作为虫草属分类的重要依据。探明一种虫草和其无性型的真正联系不仅可以 丰富真菌分类学自身内容，发现一些新的生物物质，而且也是深入开展虫草开发利用研究 的必不可少的基础性工作。现在确定的虫草菌无性型主要是根据从弹射的子囊抱子、内菌 核、及子座组织块分离的丝抱菌的形态鉴定，其中不能排除误定的可能。亦曾有人把培养 物的化学成分与天然冬虫夏草的成分进行比较，并以其与天然冬虫夏草的成分相似来说明 他们的分离物是中国冬虫夏草菌的无性型。这种反证是不可靠的。因为虫草属的另外一些 种，如蛹虫草、香棒虫草、亚香棒虫草都与中国冬虫夏草成分相似。甚至不是虫草属的真 菌菌丝体也有与之化学成分相同的报道。梁宗琦提出:可根据子囊袍子微循环产抱的方法 确定无性型，不仅简便可靠且具有很高的实用性。但是，不同种的虫草菌次生抱子萌发和 微循环产抱的条件各不相同，因此在只获得少量子囊抱子的情况下未必能实现微循环产抱 的操作。 蒙山九州虫草是我们在山东蒙山采取的，经由郭英兰先生确认为九州虫草 (C.kyushuensis)。它的寄主是豆天蛾(ClamsbilineataWalketr)幼虫，俗称豆虫。这是目前 唯一发现的寄主为豆虫的虫草菌。根据我们现有的对该虫草与冬虫夏草的化学成分检测、 生药药效及体外抑瘤实验研究，蒙山九州虫草有望替代冬虫夏草应用于临床，有着较好的 应用前景。我们试图对该虫草菌的无性型及有性型阶段从经典的真菌分类学和应用现代分 子生物学技术两方面加以研究，以期为今后进一步研究工作打下良好的基础。值得注意的 是，二十世纪80年代分子生物学在真菌领域的研究取得长足进展，覃菌的分子生物学研 vi[ 山东大学博士论文 究迅速开展。在世代交替研究上，有报道RAPD-PCR技术在虫草无性型的确定中得到了应 用，但是不容忽视的是，RAPD技术由于工作量大、重复性差，在实际实验工作中应用受 到限制。检索近期国外文献，rDNA区己成为人们研究的重点。核糖体 RNA (rRNA)是 细胞中最古老的分子之一，具有结构、功能和进化的同源性。编码其rRNA前体的基因 即rDNA，它是基因组DNA中中等重复并有转录活性的基因家族。本身具有进化的高度 保守性，同时又富含高可变区域，成为较为理想的虫草无性型鉴定及系统学研究对象。 核普类成分是虫草重要的活性成分，具有明显的药理作用。其中，虫草素((Cordycepin) 即3‘一脱氧腺昔，为含氮配糖体的核酸衍生物，属嗓吟类生物碱，早在20世纪七十年代 就己被发现有抑制肿瘤、抗疟原虫和抑制mRNA翻译的作用;九十年代研究发现，添加ADA 抑制剂对其细胞毒性的表达起着重要作用，虫草素的研究从而获得突破性进展，美国1997 年己将虫草素用于一期临床实验，治疗急性前B和前T淋巴细胞白血病患者;同时，虫草 素还表现出极强的抗真菌、抗H工V-I型病毒和选择性抑制梭菌属细菌活性。虫草素的存在 与否因虫草属菌种不同而异，现有研究多集中于蛹虫草，冬虫夏草亦有相关论文，但尚未 见到其它虫草的报道。目前虫草核昔类组分的分离检测研究多采用薄层层析和高压液相色 谱法。 本文采用经典的形态分类学方法首次鉴定国内新记录种一九州虫草的无性型为九州轮 枝菌，描述了其菌落、菌丝、产抱细胞、分生抱子的形态、大小、着生方式等特征;并利 用无性型菌株回接其天然寄主获得成功，完整的重现了该虫草的生活史，获得了有性型子 实体。通过扫描电镜和透射电镜应用研究，比较观察了野生虫草及人工虫草的子座、子囊 壳、子囊、菌丝、疏丝组织细胞等特征最终对九州虫草的无性型予以确证。