铜绿假单胞菌随机扩增DNA多态性分子流行病学研究.pdfVIP

中文摘要 铜绿假单胞菌随机扩增DNA多态性 分子流行病学研究 摘 要 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)为常见 的条件致病菌，，“泛存在于自然界、医院环境及人体的皮肤、 肠道和呼吸道，极易造成严重的院内变叉感染甚至暴发流 行，在医院感染中占有重要位置。近年来由于广谱抗生素和 激素的』一泛使用，铜绿假单胞菌的耐药菌株迅速增加并出现 多重耐药菌株，因此建立一种简单、快速、可靠、有普遍实 用性的分型方法对该菌进行流行病学研究非常必要。随机引 物扩增DNA多态性分析技术一RAPD是一种新的揭示基因 组多态性的快速分型方法，该法所需标本量极少，技术操作 简便，灵敏度高，特异性强，分型及分辨力高，是在分子水 平上对微生物感染的病原学、发病机理及流行病学研究的较 理想的方法。RAPD分型系统在临床中主要用以鉴别二菌株 是否同源，即菌株间的相互关系，以发现疾病可能的潜在传 染源、治疗失败或反复感染的原因，以及致病菌在人与人之 ，间的可能传播途径。近两年国内外已有不少将RAPD应用在 细菌性医院感染的分子流行病学研究的报道。最新资料显 示，铜绿假单胞菌致医院感染居5大革兰氏阴性杆菌的首位， 因此应用RAPD技术对铜绿假单胞菌进行分型在流行病学调 查、追踪传染源和传播途径等方面具有重要意义。 目的：本课题采用RAPD技术，调查铜绿假单胞菌在临 床各科中的流行情况，并将RAPD分型与耐药谱分型进行比 中史摘要 较，同时对RAPD的反应体系进行优化，以期建立稳定的临 床检测系统，在控制院内感染的流行病研究中发挥更大的作 用。 方法：①标本收集及细菌鉴定、药敏试验：将取样的各 种标本接种麦康凯选择培养基J：，35℃培养箱培养48h。挑 取氧化酶阳性、有金属光泽菌株，用非发酵／弧菌科生化药敏 板进行鉴定及药敏，由微生物分析系统杏询即可。②细菌 DNA制备：将收集的湿菌体重悬于SE液中，加入SDS， 60℃水浴10rain；加入水饱和酚、氯仿．异戊醇，充分振摇脱 蛋白质5 水相，重复脱蛋白质l～2次；37。C作用30～60min降解 RNA；再吸出上层水相，加2倍体积的冰冷无水乙醇，用玻 璃棒搅出丝状沉淀的DNA。等玻璃棒上的乙醇挥发干，将其 溶于TE缓冲液中，置4|。C备用。③PeR反应体系组成与扩 u1，4种dNTPs各200umolFL， 增条件：反应总体积为25 l。将反应成分混合物置于PCR “mol／L，模板浓度0．05ng／u ×35循环，72℃5min。(引物、镁离子、模板浓度、温度及 ’ l， 循环参数值的确定采用单因素设计)④取扩增产物10u v，2小时。⑤紫外透射 于159／L琼脂糖凝胶电泳，恒压80 仪下观测照相。 结果：①本试验在同等条件下集中取样，3天内共分离 出27株铜绿假单胞菌，在重症监护病房ICU分离出12株， 其中来自呼吸机标本2株，床头柜标本2株，空气标本l株， 护士手部标本I株，另6株分离自三位病人的痰液；其它标 中文摘要 本15株，其中分离自痰液9株，脓性分泌物4株，尿液2 株。②27株铜绿假单胞菌依照抗生素耐药谱不同共分成6种 型别，其中I型对哌拉西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢他 啶、头孢哌酮、庆大霉索、妥布霉素耐药，对亚胺培南、氧 氟沙星、环丙沙星、阿米卡星敏感，对诺氟沙星中度敏感， 共12株，占44．5％，其中8株来自ICU病房，表明ICU有 该菌的暴发流行，并提示可能有该菌株的交叉感染；II型只 对头孢唑啉、头孢呋辛耐药，对其它9种抗