人IGFBP-3+cDNA克隆、表达及对肝癌细胞抑制作用.pdfVIP

摘要 研究背景与目的：作为一个重要的抗癌基因，IGFBP-3受到越来 越广泛的重视。它对常见的恶性肿瘤如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等均 有明显的抑制作用。为了探讨其在肝癌发病机制中的作用，为肝癌的 诊治提供新的方法，我们拟测定病毒性肝炎及肝癌患者血清IGFBP一3 cDNA， 浓度及肝组织中IGFBP一3的表达情况。同时克隆人IGFBP一3 构建真核表达重组载体，并研究其对肝癌细胞增殖分裂及凋亡的影 响。 材料与方法：1．收集不同类型病毒性肝炎、肝硬化以及肝癌患者 的血清，用酶联免疫的方法测定血清中IGFBP一3的浓度。同时，采用 免疫组织化学染色的方法对病毒性肝炎及肝癌患者肝组织标本中的 cDNA的序列，结 IGFBP-3进行测定。2．根据GenBank中入IGFBP一3 熟IGFBP一3cDNA片段，然后将其定向克隆到载体pcDNA3．1(+)中， 构建真核表达重组载体pcDNA3．1-BP3。并用PCR、限制性内切酶酶切 Blot测定细胞培养上清中IGFBP一3的含量，同时用免疫组织化学染 色的方法测定细胞内IGFBP-3的含量。4．应用细胞增殖实验、脱氧核 糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)、流式细胞仪细 胞周期测定等方法观察内源性IGFBP一3对肝癌细胞Hep3B的抑制作 用。 结果： 1．正常对照、急性肝炎、慢性肝炎中度、慢性肝炎重度、慢性重型 肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中IGFBP一3的浓度分别为 3361．38±584．11、 4891．63±1482．91、4243．88±1086．02、 1951．13±791．96、1146．93±443．15及 3021．63±946．48、 急性肝炎组外，各组患者血清IGFBP一3浓度均明显降低；随着病情的 加重，血清IGFBP-3浓度逐渐降低。与正常对照，急性、慢性病毒性 肝炎患者比较，肝癌患者血清IGFBP一3水平显蔷降低，但与重型肝炎 及肝硬化患者相比均没有显著性差异。血清IGFBP-3与血清白蛋白、 前自蛋白呈正相关，与凝血酶原时间、总胆红素、直接胆红素呈负相 关。 2．正常对照、慢性肝炎、肝硬化及肝癌组织中IGFBP-3的表达阳性 0．1599～0．3061。肝癌组织中IGFBP一3的表达强度明显低于肝硬化、 慢性肝炎及正常对照肝组织(pO．05)；肝硬化肝组织明显低于正常 肝组织(pO．05)；而在肝硬化与慢性肝炎肝组织之间，以及慢性肝 炎肝组织与正常肝组织之间无显著区别(p0．05)。 进行鉴定，结果正确。序列中包含了起始密码子和终止密码子，方向 正确。 细胞株。采用WesternBlot测定，稳定转染了pcDNA3．卜BP3质粒的 蛋白条带很弱。同时用免疫组织化学染色的方法测定，细胞中 IGFBP-3基因在转染细胞中成功获得表达。 5．通过细胞倍增实验，pcDNA3。1-BP3细胞倍增时间为19．34小时， 但细胞融合时细胞总数没有明显区别。TUNEL检测发现，相同培养条 肝癌细胞Hep3B的增殖，促进细胞的凋亡。 结论： 1．血清IGFBP-3的浓度可反映各型病毒性肝炎患者肝功能的贮备情 况。血清IGFBP一3的显著降低对肝癌的诊断有辅助意义： 2．随着肝功能损害的加重，肝组织中IGFBP一3表达强度降低。肝癌 组织中IGFBP一3表达的显著降低可能与其致病机制相关； 3．成功的构建了人IGFBP一3 cDNA真核表达载体pcDNA3．卜BP3； GFBP一3cDNA 在稳定转染细胞株内获得充分表达； 5．发现内源性IGFBP一3对肝癌细胞Hep3B的增殖抑制及凋亡促进作 用，为进一步研究其在肝癌发病机制中的作用，以及作为基因治疗的 潜在靶目标提供了理论前提和基础。 关键词 胰岛素样生长因子结合蛋白一3，肝细胞癌，凋亡，基因 克隆 ABSTRACT