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人卵泡抑素基因克隆及其在P.pastoris和E.coli中的表达
中文详细摘要
的作用,但当时对其作用机制不甚了解。1990年,人们发现FS是激活素(Activin,
factor,TGF)超家族成
growth
ACT)结合蛋白。ACT是转化生长因予(Transforming
员,具有广泛的生物学作用。ACT通过与细胞表面的特异性受体,即I型和II
型受体结合,经Smad系列蛋白进行信号转导,调控目的基因的表达以发挥其生
物学效应。Fs与ACT结合后,阻断ACT与其受体的结合,从而中和ACT的生
物学作用。由于ACT是一种具有多种功能的细胞因子,能调节垂体前叶激素分
泌、红细胞生成、神经细胞存活及胚胎发育等,而Fs可拮抗ACT的这些作用,
因此ACT和Fs共同构成了一个维持组织器官生长发育和代谢的平衡系统。进一
步研究发现,ACT.FS系统对组织损伤后修复、重构和纤维化具有调控作用,如
外源性FS能促进大鼠残肝再生,此外,ACT还参与肝纤维化的形成。在正常肝
组织中,ACT表达一般位于肝细胞胞浆中,但当肝组织发生纤维化时,ACT表
stellate
达主要位于纤维间隔和激活的肝星状细胞(Hepaticcell,Hsc)。ACT还能
刺激HSC分泌纤维连接蛋白。由于FS是ACT结合蛋白,能与ACT不可逆结合,
阻断ACT的生物学活性,FS有可能通过拮抗ACT防治肝纤维化。对进一步开展
FS的研究具有重要的意义。
~、人FS基因克隆
我们从人肝组织中抽提总RNA,1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定其核苷酸链的完
整性;根据基因库中公布的人FS基因序列设计引物,应用Pfu
DNA聚合酶,通
过逆转录·多聚酶链反应(ReVerse chain
transcription
polymerase
reaction,RT.PcR)
的方法扩增人FS全长基因片段,将扩增的基因片段回收纯化后,亚克隆入
PMDl
chain
选转化子,多聚酶链反应(P01ymerase
双酶切验证后进行DNA序列分析,将DNA测序结果进行BIast分析后发现,在
所克隆的人FS基因的编码区中无基因突变。
二、人FS基因在户pastoris中的表达
DNA聚合酶,通过PCR的方法
我们以PMDl8-T—FS317为模板,采用Pfu
之间,但其表达量不高,难以满足蛋白纯化要求。
三、人Fs基因在Ecoli中的融合表达
B,经
选择性平板筛选获得重组转化子,转化予发酵,菌体经超声破菌离心后,将上清
液和沉淀分别进行SOS—PAGE分析,结果发现,融合表达蛋白大小为58KD,以
获得的转化子发酵表达,通过SDS.PAGE和Western
blot分析发现,融合蛋白大
小为36KD,主要以包涵体存在,但有少量为可溶性蛋白。
对GST—FS288包涵体蛋自进行分离纯化研究。将包涵体洗涤后,采用8M脲
进行包涵体蛋白的体外复性,结果发现,变性包涵体蛋白经CM.sepharose后很容
易得到纯化,在体外复性过程中,蛋白的收率不高,但我们仍然获得少量复性
GST-FS288融合蛋白样品。
四、重组人FS288及GST—FS288融合蛋白的活性测定
对ACT
人FS和大肠杆菌BL21表达的GST—FS288能剂量依赖性地抑制ACT
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