RGD依赖整合素信号通路对肝纤维化大鼠、肝星状细胞胶原代谢调控作用及丹参单体干预研究.pdf

中文摘要 RGD依赖的整合素信号通路对肝纤维化大鼠、肝星状细胞 胶原代谢的调控作用及丹参单体干预研究 摘 要 肝纤维化(hepaticfibrosis)是各种慢性肝脏疾病导致的细胞外间质 (extracellular 肝损伤共同的病理变化，有很高的发病率和死亡率。肝纤维化的主要 病因包括病毒性肝炎、酒精中毒以及胆道梗阻等。肝星状细胞(hepatic stellate 况下，HSCs主要储存维生素A，并发生少量增殖，合成少量胶原。然 而，肝损伤后，HSCs内维生素A消失并转化成肌成纤维样细胞，即活 化的HSCs，表达Q一平滑肌肌动蛋白(a--smoothmuscleactin，Q— SMA)并且合成各种ECM成分。 基质金属蛋白酶(matrix inhibitorsofmatrix 蛋白，是ECM成分的主要受体，是细胞内外信息交流的桥梁，因此， 整合素可能介导了ECM对脚s和TIMPs分泌的调节。 ECM与整合素结合首先引起粘着斑激酶(focaladhesionkinase， adhesion N． FAK)分子聚集在粘着斑(focal 途径，其中比较清楚的是RAS依赖的丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activatedprotein 酶l／2(extracellularsignal-regulated 为切入点，有机结合整体和离体试验，研究整合素信号通路在肝纤维 中文摘要 化及HSCs中对MMP及TIMP的影响。实验内容主要包括以下四部分： 第一部分：MMP．13、TIMP．1在大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达 目的：探讨实验性大鼠肝纤维化形成过程中与ECM代谢有关的 之间的相互关系。 duct 方法：采用胆总管结#t(bileligation，BDL)大鼠肝纤维化模型， 将80只雄性SpragueDawley大鼠随机分成假手术组与模型组。模型组 组与4wk模型组同批麻醉。采用HE染色确定模型建立情况，Masson 三色染色测定ECM沉积情况；免疫组织化学方法研究I型胶原在肝纤 维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变化；RT．PCR方法研究 MMP．13 mRNA在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变 化；原位杂交和Westernblot技术分别观察TIMP．1mRNA及蛋白表达 情况。 结果：@Masson三色染色显示随着肝纤维化的发展，造模l～4wk 大鼠肝组织内胶原纤维所占的面积(10．41％±1．33％，17．32％±1．53％， 1．14％)，P0．05。②随着肝纤维化发展I型胶原在肝脏内大量沉积， 从汇管区向外延伸，并广泛存在于纤维间隔及增生的小胆管周围，中 央静脉周围强阳性染色，增生的粗大的胶原纤维包绕肝细胞形成明显 大鼠肝组织内的I型胶原阳性面积分别为8．57±1．88％，13．51±2．93％， 对照组假手术组(5．35±1．88％)，P0．01。即肝纤维化程度越重，I 型胶原染色阳性面积所占比例越大。③MMP．13mRNA在肝纤维化形 成过程中无明显变化。④随着结扎时间的延长，TIMP．1mRNA的表达 0．ol，与I型胶原呈显著正相关。⑤正常肝组织TIMP．1蛋白微量表达， 造模6h开始上调，造模4wkTIMP．1表达最高，比假手术组增加1倍 2 中文摘要 以上。 结论：肝纤维化形成过程中ECM沉积是其主要病理改变，其中I 型胶原增加最明显；肝纤维化形成过程中主要是TIMP—l表达的变化， 无论是蛋白水平还是mRNA水平，都显著增加，MMP．13mRNA无显 著变化。 第二部分：精-甘．天冬．丝氨酸四肽对肝星状细胞胶原代谢的影响及机制 研究 目的：探讨精．甘．天冬．丝氨酸(RGDS)四肽对纤维粘连蛋白 的影响，为利用RGDS四肽调控HSCs胶原代谢提供实验理论依据。 测定HSCs胶原合成；采用甲苯胺兰染色方法测定细胞粘附率；RT．PCR 3 方法检测MM