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嗜热链球菌的筛选及其高活性菌粉制备 摘要：为获得优良酸奶发酵剂嗜热链球菌菌株，并确定制备高活性菌粉的培养基与保护剂利用改良TJA培养基，自市售酸奶中分离纯化出6株球菌，经生理生化试验鉴定为嗜热链球菌。进一步对它们的发酵特性进行比较，结果表明ST4发酵性能优良。以10%复原脱脂乳为基础培养基，通过正交试验方法优化得出ST4最佳增殖培养基配方为酵母粉0.5%、番茄汁7.5%、麦芽汁7.5%、乳清粉7.5%，活菌数达到1.72×109 cfu/mL。正交试验优化所得ST4的最佳保护剂配方为海藻糖20%、乳糖2.5%、谷氨酸钠5%、甘油0.5%，经冷冻干燥后其活菌数达到1.56×1011 cfu/g。 关键词：嗜热链球菌；筛选；增殖培养；保护剂 嗜热链球菌是酸奶发酵剂的重要组成菌株，它可通过发酵牛乳产生乳酸、胞外多糖以及特征性风味物质，赋予了酸奶产品独特的质地和风味。嗜热链球菌发酵特性的差异直接影响到酸奶产品的质量，而且不同菌株的发酵特性也存在着显著差异，所以筛选具有优良特性的嗜热链球菌是成功制备酸奶发酵剂的基础。 自19世纪末20世纪初，乳业发达的西方国家就开始研制浓缩型乳酸菌发酵剂，目前已实现商业化生产，并涌现出一批以丹麦汉森公司和丹尼斯克公司为代表的知名发酵剂制造商。酸奶发酵剂的制备技术主要包括以下5个方面：菌株的选育、增殖培养基筛选、发酵过程控制、菌体的富集浓缩、菌体的制备方式。虽然近些年我国科研人员在发酵剂研究方面取得了较大进展，但由于缺乏具有自主知识产权的菌株，目前我国使用的酸奶发酵剂产品主要依赖于进口。发酵剂的制备技术不完善、发酵液活菌数高但菌株活力低、冻干菌粉抗逆性差保存期短等问题导致产业化应用程度不高，因此与国际先进水平相比还存在较大差距。 本文对嗜热链球菌进行了分离筛选和发酵特性研究，并对嗜热链球菌的增殖培养基和冻干保护剂进行优化，为今后能够研制出成本低、发酵性能稳定、产品质量与国外同类产品接近的酸奶发酵剂提供试验参考。 1 材料与方法 1.1 菌株来源 市售蒙牛和乳业集团公司生产的新鲜原味酸牛奶，由中国农业大学食品与营养工程学 院微生物实验室提供，丹麦汉森公司和丹尼斯克公司发酵剂产品。 1.2 培养基 12%复原脱脂乳用于菌株发酵特性试验，市售三元鲜牛奶用于发酵酸奶品尝试验，改良TJA培养基用于嗜热链球菌的分离纯化(配方由中国农业大学食品与营养工程学院微生物实验室提供)。 1.3 试验方法 1.3.1 菌株的分离纯化及生理生化鉴定 无菌称量收集到的酸奶或发酵剂样品25 g于225 mL 0.85%生理盐水中，进行10倍系列稀释，取适当稀释度在改良TJA平板上划线，37 ℃培养48 h。选择活菌数在30～300之间的平板，随机挑取20%以上的菌落进行革兰染色镜检，选择样品中的优势链球菌(菌体形态特征相同)菌落进一步纯化。将纯化的菌株和实验室提供菌株参考《乳酸细菌分离鉴定及实验方法》进行形态学与生理生化鉴定。 1.3.2 酸奶制作工艺[4]及嗜热链球菌发酵性能测定酸奶制作工艺：12%干物质含量的复原脱脂乳→95 ℃水浴杀菌300 s→冷却至42 ℃→接种发酵(置于42 ℃恒温箱中培养4 h，取出立即冷却) →测定酸度、pH值，在4 ℃冷藏环境下后酵12 h后测定黏度、保水率和4 ℃冷藏条件下贮藏14 d的酸度。对发酵鲜牛奶制成的酸奶后酵24 h后进行品尝，对组织状态和风味进行文字描述。 pH值测定：发酵4 h后，采用Satorius PB-10pH计进行测定。酸度测定：采用标定后的0.1 mol/L NaOH进行测定，用吉尔涅尔度(oT)表示。黏度测定：采用旋转黏度计进行直接测定(测定时酸奶温度为4 ℃)，选用3号转子，转速为12 r/minmin，取开机后15 s的数据，取3个不同点测定数据 的平均值。 产酸速率测定：发酵4 h后，产酸速率(oT/h)=发酵结束时酸乳的酸度(oT)/发酵时间(h)。 保水率侧定：取10 g脱脂发酵乳于离心管中，在3000 r/min条件下离心10 min，倾去上清液W，其保水率为：保水率(%)=(10-W)/10×100。 酸奶组织状态和风味描述：对不同菌株发酵出的酸奶在相同温度(4 ℃)和酸度相近的(约80 oT)条件下进行品尝，分别对组织状态和风味进行文字描述。 1.3.3 增殖培养基优化正交试验设计 在10%复原脱脂乳基础培养基中添加酵母粉、番茄汁、麦芽汁、乳清粉4因素，利用L9(34)正交试验设计配制9种增殖培养基。嗜热链球菌菌株经复原脱脂乳培养基活化后，以2%的接种量分别接种于上述增殖培养基中，42 ℃恒温培养4 h后立即冷却，通过10倍系列稀释及平板倾注法检测活菌数。L9(34)正交试验设计见