04第五章兰州大学分子生物学分子生物学研究法(上).ppt

第五章 分子生物学研究法（上） 工具酶的来源 限制性内切酶的发现 限制－修饰假说 限制－修饰假说图示 完全甲基化和不完全甲基化 各种类型限制性内切酶的性质比较 Ⅱ型限制性内切酶的特点 部分Ⅱ型限制性内切酶及其切割位点 部分Ⅱ型限制性内切酶及其切割位点 限制性内切酶切割位点的多寡 同裂酶和同尾酶 同尾酶切割后连接的结果 Ⅱ型限制性内切酶所需反应条件 Ⅱ型限制性内切酶所需反应条件 限制性内切酶的命名 核酸的凝胶电泳 溴化乙锭结构式 凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围 DNA大小与迁移距离的关系 DNA分子的状态与迁移速度的关系 大分子DNA的电泳分离 脉冲电泳 物理图谱的定义 DNA聚合酶的性质 测序酶 DNA聚合酶的5’→3’聚合酶活性 切口平移标记核酸探针 切口平移法制备32P标记的探针 Klenow片段的产生 随机引物标记法制备探针 采用Klenow酶的随机引物标记法 逆转录酶 逆转录酶 T4 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 末端脱氧核苷酸转移酶催化的反应 碱性磷酸酶 两种碱性磷酸酶 碱性磷酸酶的用途 大肠杆菌DNA连接酶 DNA连接酶催化的反应 T4 DNA连接酶的特点 T4 RNA连接酶S1核酸酶（米曲霉） DNase Ⅰ（牛胰） 分子杂交 印 迹 分子杂交 Southern 杂交 Southern 印迹 Southern杂交过程 Northern印迹 斑点印迹和狭线印迹 滤膜杂交 杂交后的显色类型 生物素-11-dUTP和生物素-14-dATP的结构 地高辛-11-dUTP的结构 酶联免疫法测杂交信号 原位杂交 菌落或噬菌斑原位杂交 组织、细胞空间定位原位杂交 菌落或噬菌斑原位杂交筛选文库的基本过程 二、分子克隆 分子克隆 大肠杆菌的一般性质 大肠杆菌的遗传标记 大肠杆菌培养基 在液体培养基中生长 在固体培养基上生长 载 体 质粒（plasmid）的一般性质 质粒的遗传标记 质粒的复制类型 质粒的复制类型 严紧型控制复制 松弛型控制复制 质粒的不相容性 质粒不相容原理 质粒载体的选择 Lac操纵子调控模型 α互补的原理 α互补的原理 α互补的应用 质粒pBR322的图谱 重组pBR322质粒转化大肠杆菌后的选择方法（假设外源DNA插入到ampr基因中） pUC19质粒 pUC19质粒图谱 载体经单酶切后外源基因有两种插入方向 载体经双酶切后外源基因只有一种插入方向 重组pUC质粒转化大肠杆菌后的选择方法（外源DNA插入到 lac Z 基因中） pGEM-3z f (+/－)质粒图谱 pGEM-3z f (+/－)质粒多克隆位点序列图 穿梭质粒 穿梭质粒 λ噬菌体 λ噬菌体（λ phage）基因组的一般性质 λDNA的结构 λ噬菌体（λ phage）基因组的一般性质 λ噬菌体中央区的基因 λ噬菌体载体对大肠杆菌培养条件的要求 λ噬菌体改建成载体的基础 对重组λ噬菌体大小的要求 转化、转染和转导 插入型载体和取代型载体 λ载体的优点 合适载体的选择 插入型载体λgt10和λgt11图谱 λZAP噬菌体载体结构和其中的pBluescript噬菌粒 λZAP载体的特点 λZAP载体的特点 λZAP载体的特点 粘粒（cosmid）载体的特点 粘粒载体及其克隆步骤 粘粒（cosmid）载体的特点 粘粒（cosmid）载体的特点 DNA分子的连接 平端产生的方法 平端加连接子后连接 平端加适配器后连接 平端的同聚物加尾连接 相同粘性末端的连接 不同粘性末端的连接 设计一种新的克隆方法 Gateway技术特点 Λ噬菌体在大肠杆菌中的重组 λ噬菌体整合所需的酶 λ噬菌体切除所需的酶 Key points Gateway技术原理Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP和LR两个反应构成的。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。 Gateway的主要用途 TOPO克隆原理拓扑异构酶I在位点CCCTT切断并松弛超螺旋DNA，然后重新连接末端。这样，其同时作为限制酶和连接酶 TOPO克隆是一种将拓扑异构酶与 T- 载体相结合的 PCR 产物快速克隆系统 PCR-TOPO ，无需 DNA 连接酶做连接。牛痘（Vaccinia） 病毒拓扑异构酶 Ⅰ 可以结合在双链 DNA 的特异位点上，并可在一条链上于 5’-CCCTT 序列之后打开磷酸二酯键（cleave the phosphodiester ba