枯草芽孢杆菌B11菌株分泌拮抗物质纯化及基因文库构建.pdf

枯草芽孢杆菌B11菌株分泌的拮抗物质的纯化及 基因文库的构建 摘要 从土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌B11菌株对西瓜枯萎病菌有较强 的抑制作用，其抑制机制之一是产生拮抗物质。本研究对Bll菌株分泌 的拮抗物质进行纯化，测定其特性及抑菌机制，并构建B1l菌株的基因 文库，取得的结果如下： 通过煮沸、DEAE52阴离子交换层析和氧化铝吸附层析，将BIl菌 株分泌的两种拮抗物质(拮抗物质A、B)纯化到薄层层析斑点纯。 两种拮抗物质对蛋白酶K和胃蛋白酶稳定，拮抗物质A对胰蛋白酶 也稳定，但拮抗物质B对胰蛋白酶部分敏感。这两种拮抗物质均能耐高 温，在121℃仍能保持活性不变。 两种拮抗物质对尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusariumoxysporumf_sp． 1 375 niveum)、水稻黄单胞菌水稻变种(Xanthomonasoryzaepv．oryzae)1 solanacearumlP13菌株和水稻纹枯病菌 菌株、茄青枯拉尔氏菌(Ralstonia (Rhizoctonia solani)均有较强烈的抑制作用，但拮抗物质A对水稻稻灰 梨孢菌(nricularia grisea)没有抑制作用；而拮抗物质B对水稻稻灰梨 lag／mL的 孢菌(Pyriculariagrisea)有较强烈的抑制作用。处理浓度为4．92 h后对菌丝生长的抑制率达 拮抗物质A处理尖孢镰刀菌西瓜专化型120 52．5％，对分生孢子的产生抑制率达98．61％：处理浓度为5．08 gg／mL的拮 抗物质B处理该病菌120 h后对菌丝生长的抑制率达51．22％．对分生孢子 的产生抑制率达94．93％。 用光学显微镜观察拮抗物质A、B对尖孢镰刀菌西瓜专化型分生孢 子的作用，结果发现，拮抗物质A处理尖孢镰刀菌西瓜专化型 (V～=30／loo)分生孢子12 h后，有40％的分生孢子不能荫发，并出现 畸形，24h后全部畸形，48h后可以致使分生孢子膨大和原生质浓缩； 而拮抗物质B处理分生孢子36 h后即可使分生孢子膨大和原生质浓缩。 拮抗物质A、B对尖孢镰刀菌西瓜专化型的作用是使分生孢子表面产生 孔洞及囊状物，囊状物破裂；拮抗物质A、B可以破坏尖孢镰刀菌西瓜 专化型菌体细胞的细胞膜。 连接产物用包装蛋白包装后侵染大肠杆菌EPll00，构建了约6700个克 隆的DNA文库。从文库中随机挑选10个克隆提取质粒，质粒用BamHI 内切酶进行酶切分析，发现插入的外源DNA片段都是随机的，外源片段 平均大小有37Kb。 关键词 枯草芽孢杆菌B1l菌株拮抗物质纯化抗菌谱理化特性 作用机理基因文库 PURlFICATIONOF TWO ANTIMlCROBIAL SUBSTANCES PRODUCEDBY Bacillus subti／is STRAIN B11AND