家蝇Defensin基因原核表达条件的优化及其抑菌活性.pdfVIP

· 2458 · 广东医学 2013年 8月第 34卷第 16期 GuangdongMedicalJournalAug．2013．Vo1．34．No．16 家蝇 Defensin基因原核表达条件的优化及其 抑菌活性 许琴英 ，朱家勇 ，金小宝。，徐建华 。广东医学院寄生虫学暨临床寄生虫检验学教研室(广东湛江524023)；广东省生物活性药物研究重点实验室 (广州510006) 【摘要】 目的 优化家蝇Defensin基因原核表达条件，并初步研究其抑菌活性。方法 Defensin基因成熟肽 被克隆入 pGEX一4T一1原核表达载体中，构建重组质粒 pGEX一4T一1／Defensin，并转化宿主菌后诱导表达，表达 过程中对茵液起始浓度、IPTG浓度、诱导温度和时间进行优化。采用亲和层析法分离纯化融合蛋 白．SDS—PAGE 鉴定 目的蛋白的表达情况和分子量。用凝血酶切除谷胱甘肽标签，并通过体外抑茵实验检测其抗茵活性。结果 成功构建重组质粒pGEX一4T一1／Defensin，目的基因能够在大肠埃希菌内高效表达，分子量为4kD，与预期值 一 致，表达量约达40％。抑茵实验显示其对大肠埃希茵K D 生长有一定的抑制作用。结论 本实验为家蝇 Defensin基因功能的深入研究奠定了工作基础。 【关键词】 抗茵肽；表达；活性；Defensin 昆虫防御素(Defensin)是一类碱性小分子多肽，具 弓I物Pml(5一cgcggatccgctacttgcgatttgt一3，含BamH I 有热稳定性强、诱导源的非专一性和抗菌谱广等特点， 酶切位点)和Pm2(5一cgctcgagacacctcagttacggc一3，含 有望开发成一类新型的多肽抗生素 。由于其在组 XhoI酶切位点)，拟扩增家蝇幼虫Defensin基因的编 织中含量低，分离获得大量的天然产物很困难，而人工 码序列。引物由北京三博合成。 合成多肽的成本高 ，限制了其应用前景。因此，利用基 1．2．2 家蝇 Defensin基 因原核表达质粒构建 以 因重组技术克隆表达基因是获取昆虫抗菌肽的理想途 pUCm—T／Defensin重组质粒为模板 ，以Pml、Pm2为引 径。大肠埃希菌表达系统是最常用的基因工程表达系 物进行PCR，扩增家蝇幼虫Defensin基因的序列；扩增 统，研究者已利用该系统表达了多种蛋白。2005年 1 产物纯化后以BamH I和 XhoI对其进行酶切；此酶 月至2007年 12月，本研究在实验室已构建的含有家 切产物再与经 BamH I和 Xho I酶切后的pGEX一 蝇幼虫 Defensin基因的重组质粒 pUCm—T／Defensin 4T一1原核表达载体连接 ，构建重组质粒 pGEX一4T一 的基础上 ，将家蝇幼虫 Defensin基因克隆入原核表 1／Defensin。此重组质粒经测序正确后转化大肠埃希 达载体，对其表达条件进行优化 ，并对表达产物进行抑 菌 BL21(DE)，筛选阳性表达菌。 菌活性的研究。 1．2．3 pGEX一4T一1／Defensin重组质粒表达条件的优化 1 材料与方法 参照文献[4]的方法，挑取含有重组质粒pGEX一4T一 1．1 材料 1／Defensin的BI21(DE)单菌落进行培养 ，检测 目的 1．1．1 受体菌与载体 大肠埃希菌 DH5c~、BL21 基因在不同条件的表达水平。(1)菌液的起始浓度不 (DE。)和pUCm—T／Defensin重组质粒为广东省生物 同(0D 为 0．4、0．6、0．8、1．0)。(2)IlYFG的诱导终浓 活性药物研究重点实验室保存 ，原核表达载体pGEX一 度不同(0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2mmolfL)。(3)在 4T一1购 自Invitrogen公司。 同一 IPTG的浓度下 ，培养温度不同(28℃、30℃、35℃、 1．1．2 主要试剂 本实验所用分子生物学相关试剂 37~C)。(4)在同一 IPTG的浓