实时荧光定量聚合酶链式反应检测瘢痕疙瘩中核心蛋白多糖的表达.pdfVIP

星Q 生璺旦箜 鲞筮 ChinJMedAesthCosmet，August2013，Vo1．19，No．4 分化和代谢 ，与细胞 因子相互作用影响细胞生物学 DCN、TGF—1序列及相关文献进行引物设计，8肌 功能 ，对瘢痕的发生发展有明显的调节作用。核心 动蛋 白作为内参照。DCN 167bp；正引物 ：5一GCT— 蛋白多糖 (decorin，DCN)能特异性抑制 131转化生 GGACCGTTTCAACAGAGAG一3；负 引 物：5一 长因子 (TGF—t31)的生物活性 、促进纤维化组织结构 CCCAAATCAGAACACTGGACCAC一3 ；TGF一81 正常化及减轻 ECM沉积，为瘢痕疙瘩的治疗提供 303bp；正 引 物 ：5，_GCTCCTGTGACAGCAGG— 了新的思路。本研究使用实时荧光定量聚合酶链式 GAT一3；负 引物 ：5一GGCAGAAGTTGGCATGG— 反应 (FQ—PCR)对瘢痕疙瘩 中DCN的表达及含量 TAG～3；8肌动 蛋 白 159bp；正 引物 ：5一AGTT— 改变进行研究 ，并对其与 TGF—J31的相互作用进行 GCGTTACACCCTTTCTT一3；负 引物 ：5r_TCAC— 分析，从基因水平深入探索 DCN在瘢痕疙瘩防治 CTTCACCGTTCCAGT一3。根据最佳反应条件 ，进 中的作用。 行 FQ—PCR反应，反应循环条件见表 1。(4)扩增产 物的检测：采用 1 琼脂糖凝胶进行 电泳分析，观 材料与方法 察电泳结果。根据公式 ： 一 △Ct一 (Ct目的基因一C管家基因)实验组一 (Cz目的基因--Ct~ )对照组， 、 实验材料 30例组织标本 ，经病理组织学切片检查。实验 用 2 幽计算相对表达量的差值。 分为 3组 ：(1)实验组 (瘢痕疙瘩组)：18例，男 14例 ， 表 1 FQ-PCR反应循环条件 女4例 ，平均年龄 26．39岁 ；(2)对照组 1(正常瘢痕 Tab1 FQ-PCR real—timecondition 组)：6例 ，为扁平瘢痕或萎缩性瘢痕，男 5例 ，女 1 例 ，平均年龄 25．64岁 ；(3)对照组 2(正常皮肤组)：6 例，男 5例 ，女 1例 ，平均年龄 2O．39岁。以上 30例 样本 ，每 1例均按照以下方法进行研究观察 。 二、实验方法 1．FB培养 ：标本去除皮下脂肪、表皮 ，剪碎为 0．5～1．0mm。组织块 ，在 50ml培养瓶瓶壁上均匀 布置 ，加入含 1O 胎牛血清的Dulbecco改 良Eagle (DMEM)培养液，放入孵育箱，每隔 2～3d更换培 养液；当FB呈密集细胞集落或铺满瓶底时，进行传 注 ：B肌动蛋 白反应条件 ，根据 DCN反应条件 而定 代培养。 2．电镜检测：收集培养瓶内细胞 ，加入 1ml左 结 果 右固定液 ，包埋 、聚合、切片、枸橼酸铅染色后进行电 一 、 细胞形态学观察 镜观察 ，摄片存档 (切片厚度 10～100nm)。 光镜下 FB贴壁生长 ，梭形或多角形 ，细胞生长 3．FQ-PCR检测 ：(1)细胞 内总 RNA 的提取 ：细 排列呈放射状 、栅栏状