sTRAIL真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞增殖影响的体外实验研究.docVIP

sTRAIL真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞增殖影响的体外实验研究 作者：李谷 马力 龚江标 徐锦芳 杨小锋 詹仁雅 【摘要】 　　目的　构建重组基因表达载体PcDNA-sTRAIL并观察其对C6胶质瘤细胞的抑制作用。方法 通过PCR扩增和定向克隆技术构建重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL。以阳离子脂质体介导转染C6胶质瘤细胞并用流式细胞仪观测对细胞增殖的影响。结果 经过测序鉴定和蛋白表达检测证实，重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL构建成功。阳离子脂质体介导质粒转染C6胶质瘤细胞阳性率达50%。脂质体PcDNA-sTRAIL转染C6细胞后,相比未转染、空质粒转染、Lipofectin转染组C6胶质瘤细胞增殖抑制、细胞凋亡明显增加（t分别=9.52、7.20、2.84,P均0.05）。结论 成功构建了sTRAIL基因的真核表达载体，并从体外实验中初步证实了其对C6胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用。 【关键词】 胶质瘤 基因治疗 真核表达载体 转染 　　目前胶质瘤的治疗是以手术为主的综合治疗，并辅以术前术后的放射治疗和化学治疗。但总体疗效尚不理想[1]。基因治疗被认为是继以上治疗手段后具有良好效果的新的治疗手段。可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（soluble tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligands，sTRAIL）自发现并成功地克隆出来已被证实存在明确的抗肿瘤效果，为中枢神经系统的肿瘤治疗带来了新的希望[2]。本次研究构建重组基因表达载体PcDNA-sTRAIL并观察其对C6胶质瘤细胞的抑制作用，为胶质瘤治疗的进一步研究提供基础。 　　1　材料与方法 　1.1　材料　 　　1.1.1　试剂及仪器　大鼠C6胶质瘤细胞系（由上海生化与细胞生物学研究所提供）；Lipofectin（由美国Gibco公司生产）；Access RT-PCR System(由美国Promega公司生产)； PcDNA(由美国Invotrigen公司生产)； PUCm－T载体、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒（由上海生工生物工程技术服务有限公司生产）；流式细胞仪、BioER基因扩增仪（由美国Becton-Dickinson公司生产）；NS25 OLYMPUS倒置显微镜（由日本OLYMPUS公司生产）；垂直电泳仪和半干电转仪（由美国Bio-Rad公司生产）；基因脉冲仪及酶标仪（由美国Bio-Rad公司生产）。 　　1.2　实验方法 　　1.2.1　sTRAIL的基因克隆及PcDNA-sTRAIL重组表达载体建立　Trizol一步法提取总RNA，以提取液作为模板采用cDNA逆转录与PCR 扩增一步法试剂盒进行RT-PCR反应得到DNA并纯化。引物设计如下： 　　上游：5-GCGAATTCAGTATGGTGAGAGAAA－GAGGTC-3（含有EcoRⅠ酶切位点） 　　下游：5-ACAGTAGGATCCTCCAGGTCAGTTA－GCCA-3（含有BamHⅠ酶切位点） 　　20ul反应体系中进行PCR反应，循环条件设置如下：95℃ 3min 1 个循环；94℃ 1min ，55℃ 1min，72℃ 1min30s 35 个循环；72℃ 8min 1个循环；4℃ 维持。用EcoRI和BamHI分别对载体PUCm-T和外源DNA双酶切，纯化后连接，构建T-sTRAIL质粒。T-sTRAIL质粒转化感受态细菌TGI，用含有Amp抗性的LB培养基筛选质粒。碱裂解法抽提质粒T-sTRAI，用EcoRI和BamHI双酶切后凝胶电泳观察目的片段sTRAIL长度后并送上海生工公司进行序列测定。鉴定无误后将PcDNA 3.1和T-sTRAIL分别用EcoRI和BamHI双酶切并分离纯化后用T4连接酶连接，完成重组表达载体PcDNA-sTRAIL的构建并测序验证。提取前述大肠杆菌菌落利用Western blotting进行目标蛋白鉴定。 　　1.2.2　转染sTRAIL基因对C6胶质瘤细胞增殖影响的体外研究　PcDNA-sTRAIL质粒体外扩增后利用阳离子脂质体法介导PcDNA-sTRAIL质粒载体导入C6细胞。实验组：分别以DMEM无血清培养基稀释5ug DNA和5ul Lipofectin至100ul，两者混匀后转移到经胰酶消化无血清培养的C6细胞培养瓶中，完全培养基继续培养24～48h后，在显微镜下观察细胞生长情况；对照组1：以同体积的PcDNA3.1代替DNA溶液；对照组2：以同体积的Lipofectin代替DNA溶液，其它操作与实验组相同；以上三组转染细胞培养48h后传代培养于含G418的浓度梯度培养液中进行抗性筛选稳定表达sTRAIL的C6细胞，用免疫组化染色对表达sTRA