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氨基酸的分离鉴定——纸层析法 实验目的：1、学习纸层析法的基本原理； 2、掌握纸层析法分离氨基酸的操作技术。 实验原理： 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 分配层析的原理可用一个模式解释（英国Martin等）：把滤纸看成是一个层析柱，可以分成若干层板，设层板的物质为A、B；且A和B的分配系数（α）分别为1和1/3；又设固定相为S，流动相为L，两相互相接触但不相混溶。 当第一层流动相中加入一定量的A、B两项物质后，溶质根据各自的分配系数在第一层的两相中分配，流动相继续在流动，此时第一层固定相与新流到的流动相之间以及原来第一层流动相与第二层固定相之间进行第二次分配，以此类推三次分配即可看出A与B最浓部分以分开，A在第二层最浓，B在第三层最浓，如果继续抽提下去，经过若干此后，A、B两物质便可完全分开。显然，分配系数越大的物质就越容易分开。 模式图如下所示： S（固定相） L（流动相） 第一次分配 第二次分配 第三次分配 第一次分配 第二次分配 第三次分配 0层 A1 B1 1层 A1/2 B1/4 A1/4 B1/16 A1/8 B1/64 A1/2 B3/4 A1/4 B3/16 A1/8 B3/64 2层 A1/4 B3/16 A1/8+ A1/8 B3/64＋B3/64 A1/4 B9/16 A1/8+ A1/8 B9/64＋B9/64 3层 A1/8 B9/64 A1/8 B27/64 图中的第二层流动相中的溶质A为1/2，B为27/32；第三层流动相中的溶质A为1/8，B为27/64；第三层 抽提一定时间后，溶剂流到接近滤液前沿1～2cm时。层析完毕，将滤液取出、干燥、用显色剂显色即可看到氨基酸在滤纸上的位置，此位置用Rf表示。 不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 板书要点：以滤纸做惰性支持物，利用不同AA在两相展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。AA在图谱上的位置用Rf值表示。Rf＝原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离） 实验器材：1.层析缸 2.毛细管 3.喷雾器 4.培养皿 5.层析滤纸 实验试剂：1.扩展剂：是4份水饱和的正丁醇和一份醋酸的混合物。将20ml正丁醇15ml水放入分液漏斗中混匀，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，再和5ml冰醋酸混合。取漏斗内的扩展剂约5ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。2.氨基酸溶液： 0.5％的赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合物（各组分浓度均为0.5％）。3.显色剂: 0.1％茚三酮-正丁醇溶液 实验步骤： 滤纸定点——点样——展层——显色——描点计算。 注意事项： 时间安排：先讲前三步待学生做好展层时再讲后面的步骤。 注意事项：因是第一次实验，向学生交代实验须知：实验目的、实验要求、实验室规则等。强调在操作过程中，手不要摸滤纸；点样直径不超过3mm；点有样品的滤纸缝成筒状，两边不能接触；点样的一端朝下, 扩展剂的液面需低于点样线1cm；即时取出滤纸, 以免出现氨基酸层析跑到滤纸的外面不能检测；并根据实验室的现有设备和实际进行实验；废液倒在废液桶中统一拿到废液池中处理。 实验报告：叙述实验的原理和操作步骤（计算各AA的Rf值并上交层析图谱）。 课后分析：效果好。学生认真操作，分离图谱清晰，赖、脯、亮等三种AA的Rf值分别为：0.2多、0.4多、0.7多，符合正常值。学生实验报告比较好：全部按时上缴：按要求、实事求实书写实验原理和操作步骤并上缴层析图谱。只是有少数同学还计算混合AA的Rf值；有少数同学用铅笔书写；少数同学版面安排不合理