重组质粒pET-OmpU构建、表达及其对锦鲤免疫保护作用.pdfVIP

m㈣0舢Ⅲm枷㈣删圳mI Y21 49982 摘要 水产动物腹水病是由拟态弧菌(聆6，面聊砌拓螂，砌z)引起的一种重要的细菌性 membrane 疾病。现阶段尚无有效的疫苗用于该病的免疫预防。外膜蛋白U(Outer proteinU，OmpU)是存在于多种病原弧菌中比较保守的主要外膜蛋白，且已探 明该蛋白是霍乱弧菌和创伤弧菌的保护性抗原。但拟态弧菌OmpU蛋白对水产 动物是否具有免疫保护作用至今尚不明了。本研究利用原核表达系统成功表达了 拟态弧菌安徽分离株的OmpU蛋白，并检测分析了可溶性重组OmpU蛋白的免 疫原性、免疫反应性以及对实验鱼的免疫保护作用。研究结果为进一步研制拟态 弧菌OmpU蛋白疫苗奠定了基础。 为了制备抗拟态弧菌抗体，将04．13安徽分离株的甲醛灭活菌体(200亿个 ／nlL)与双相乳化佐剂充分乳化制成免疫原免疫家兔。经三次免疫后，免疫兔血 清中抗菌抗体的凝集价高达l：225，完全可用于后续的Wbstemblot检测分析。 为了获得高效表达的可溶性重组OmpU蛋白，首先应用SigmlP在线分析软 行信号肽分析，发现其5’端66bp编码的22个氨基酸组成信号肽。对此，设计特 异性引物，PcR扩增切除信号肽的D，印U基因(1004bp)，将PcR扩增产物定 导时间和诱导剂浓度等因素对蛋白表达的影响，优化出OmpU蛋白最佳表达条 h，然 mmol／L 后加入O．5 IPTG继续诱导4 h，即可获得较高表达量(496mg／L)的可溶 性重组OmpU蛋白。 为了分析可溶性重组OmpU蛋白的免疫原性、免疫反应性以及对实验鱼的 免疫保护作用，在优化条件下诱导重组菌大量表达，使用镍离子金属螯合亲和层 blot分析。结果显示纯化后 析柱对可溶性重组OmpU蛋白进行纯化并做Westem 蛋白纯度达98％，浓度为3．2mg／mL，能与抗菌抗体发生特异性反应。以重组 Ompu蛋白、标签蛋白His和灭活菌体免疫锦鲤，四免后第7天心脏采血，采用 3．32吲n1L、2．95 均有不同程度升高。ompU蛋白免疫组和灭活菌体免疫组的鱼免疫保护率分别为 有良好的免疫原性和免疫反应性，对实验鱼有一定的免疫保护作用。 关键词：拟态弧菌，外膜蛋白u，可溶性表达，锦鲤，免疫保护作用 Abstract m，．面 The嬲citesdiseaseiIl animalsisan diSeasecaused aquatic important by 聊加缸淞．Butthereisn’tane任．ectivevacciIle向rthe ofthediSeaseat preventIon conscrved outermembrane relatively antigen present．The prote证U(OmpU)is be