靶向G-四链体新型小分子对MYC启动子和端粒酶活性抑制作用及其诱导肿瘤细胞凋亡.pdfVIP

靶向G．四链伴的新型小分子对MYC启动f和瑙牲謦活性的影响及茸诱导肿瘤细胞凋亡 靶向G．四链体的新型小分子对MYC启动子和端粒酶 活性的影响及其诱导肿瘤细胞凋亡 专 业：肿瘤学 硕士研究生：刘健楠 导师：朱孝峰研究员 摘要 肿瘤是威胁人类生命和健康的主要疾病，是人类的第二号杀手。化疗是肿瘤 治疗的三大手段之一，但目前传统的化疗药物主要是细胞毒药物，其作用机理是 依赖肿瘤细胞与正常细胞在生长、修复、死亡的动力学差异。因此这类药不可避 免地会影响正常细胞，带来临床上常见的各种不良反应。另一方面耐药性的产生 也限制了这类药物在临床上的应用。靶向肿瘤特异性新靶点的抗癌药物研究，已 经成为近几年的研究热点。 最常见的DNA是单链或双链螺旋结构，但在K十、Na+等离子的存在下，富 含鸟嘌呤碱基重复序列的核苷酸能够形成G-四链体结构。人端粒DNA由5，- (TTAGGG)．3’重复序列和一个3’悬突端组成，这一段单链结构在生理条件下有 可能会形成G．四链体结构。人们发现除了染色体端粒末端，一些重要的癌基因如 粒维持机制和转录调节已成为肿瘤药物设计的重要靶点，所以G_四链体结构有 可能成为抗肿瘤药物的新靶点。 白叶藤碱是一种天然的生物碱，它的化合物和盐类有许多有用的生物学功 能。在其从天然产物中分离之前就已有关于合成的报道。这类化合物可以从中非 和西非的居民用于治疗疟疾的非洲植物Cryptolepisanguilolenta中分离，也有报 导它们可用于抗高血糖症。本实验室以端粒DNA的G-四链体为靶点，利用CD 光谱分析和端粒酶活性检测的酶联免疫TRAP-ELISA)方法，已经筛选发现白叶 藤碱类似物可促进富含鸟嘌呤的DNA序列发生折叠形成G．四链体，诱导端粒的 靶向G．四链体的新型小分子对MYC启动子和端粒酶活性的影响及其诱导肿瘤细胞穗亡 缩短和肿瘤细胞的衰老。 c．myc是一种重要的癌基因是细胞由G1期进入S期的必需因子。c-myc 蛋白作为核转录调节因子，可与MAX蛋白形成稳定的二聚体，与DNA特异序 列相结合，直接激活基因的转录，参与调节细胞的增殖、分化和凋亡。并且c-myc 启动子核酸酶超敏单元mI(NHEIIII)区域，存在着容易形成G-四链体的结构。 因此寻找既抑制端粒功能又抑制myc启动子活性的靶向G-四链体的新型小分 子，具有更好的应用前景。 许多种肿瘤细胞包括急性髓系白血病，都有端粒酶的高表达。c-myc是一种 重要的癌基因，在白血病细胞和其他肿瘤细胞中也有过表达。本次研究在白叶藤 碱类似物能够稳定端粒形成的G．四链体结构的基础上，利用PCR-stop实验从白 叶藤碱中筛选出与c-myc启动子相互作用的G一四链体小分子配体，并研究其对 肿瘤细胞c．myc及其调控的下游基因E2F1、hTERT的表达的影响；对端粒结合 蛋白TRFl和TRF2表达的影响：对端粒酶活性的影响；对凋亡诱导及其作用机 制等方面进行了进一步的探讨，为从白叶藤碱类似物中开发高效、低毒的新型抗 癌药物打下坚实的基础。 一、 活性的抑制作用 我们首先用专门的PCR-stop实验对白叶藤碱类似物进行筛选。根据myc 启动子核酸酶超敏单元ml区域DNA序列，设计引物。正常情况下，检测寡核 苷酸可以和部分与检测寡核苷酸末端富含鸟嘌呤的碱基杂交的互补核苷酸结合， 在Taq酶催化下延伸成双链PCR产物。而在相应的G-四链体稳定剂或促进剂存 在下，寡核苷酸折叠形成稳定的G．四链体结构，不能与互补核苷酸结合，检测 不到相应的PCR产物。经过筛选，可以看到自叶藤碱类似物SYUIQ．5和SYUIQ-2 能明显抑制双链PCR产物，且随着浓度的增加抑制作用越明显，并且sYUIQ．5 促进c-myc启动子区域形成G．四链体，显著抑制癌基因c．myc启动子的活性。 二、 Ⅱ 靶向0．四链体的新型小分产对MYC启动子和端粒酶活性的影响投苴诱导肿橱细胞凋亡 控的下游基因和端粒结合因子的影响 达的影响 c-myc通过扩增活化或基因重排而异常激活，在白血病的发生和发展中起 着重要的作用，是白血病基因治疗理想的靶位点。PCR-stop实验说明了SYUIQ．5 在人急性早幼粒白血病细胞删L-60内对C