哺乳动物雷帕霉素靶蛋白高效干扰片段筛选及RNAi慢病毒载体构建.pdf

摘要 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白高效干扰片段筛选及 RNAi慢病毒载体的构建 硕士研究生：郑富霞 导 师：苗丽君副教授 郑州大学第一附属医院呼吸与危重症医学科 河南郑州450052 摘要 肺癌是世界上死亡率最高的肿瘤，已经成为威胁人类健康的全球性问题。 在中国，肺癌的发病率仍然处于继续升高趋势，男性肺癌占各种肿瘤发病的第 一位，女性肺癌占第二位。大部分肺癌患者就诊时候已经处于局部晚期或已经 有远处转移，常规的治疗一般是手术、放疗、化疗、生物细胞治疗以及综合性 治疗，但效果均不尽人意，于是寻找治疗肺癌的新技术已然成为现今的研究热 点。 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target 编码的蛋白质由2549个氨基酸组成，分子量为289kD，因处于信号转导通路的 中心环节而备受关注。roTOR在细胞生长、分化以及增殖等基本功能过程中起 着中心调节的作用，同时也在调节细胞周期、蛋白质的合成与降解、细胞能量 代谢等多种途径发挥着重要的生理功能。因此，mTOR已经成为现今肿瘤靶向 基因治疗的热点。 1 nt一．,23nt双链 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指通过一些小的2 RNA(doublestrande RNA，shRNA) RNA，dsRNA)或短发央状RNA(shoft hairpin 在mRNA水平上高效、特异地阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出其基因缺 失的表型的过程。RNAi具有快速、经济、高效、操作简单等特点，其理论及相 关技术已经渗透到生命科学的各个领域，在基因功能及疾病的基因治疗方面已 被广泛应用。 基因治疗的关键因素在于选择最佳的转基因载体、最恰当的目的基因、且 摘要 能实现目的基因的表达可控性。慢病毒载体可以感染绝大多数细胞，包括分裂 期、非分裂期细胞，特别适合于多种细胞的RNAi实验。利用慢病毒载体，可以 高效感染细胞，介导外源性基因在细胞中的表达．研究细胞可生长的调控，过表 达特定基因的整合，且感染细胞后不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外 源基因。 目的 本研究采用RNAi技术，应用化学合成siRNA在人肺腺癌A549细胞中筛选 出roTOR基因的高效位点，构建重组慢病毒表达载体，为肺癌的基因治疗探索 新的研究方法。 方法 1．严格按照RNAi设计原则为mTOR基因设计4个干扰位点和阴性对照 (Negative 2000转染试剂转染人肺腺癌A549细胞，24h后，每同通过荧光 Lipofectamine 分别检测roTOR基因在24h后mRNA水平和48h后蛋白水平的表达，筛选出 高效干扰位点片段再用于慢病毒载体构建。 2．针对己经筛选确定的roTOR基因高效干扰位点片段，合成位点片段的双 2．0质粒共转染293T 链DNA，接入pGCL．GFP载体，再与pHelper1．0和pHelper 细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞中GFP蛋白的表达水平检测病毒滴度并进 行活性鉴定。 结果 1．成功筛选出mTOR基因的siRNA高效干扰位点。 2．mTOR 达均显著下调。 3．成功构建针对roTOR基因的慢病毒siRNA载体，收获病毒上清并检测病 毒滴度为Ixl08UT／ml。 Ⅱ 摘要 结论 1