实验内容一、斑马鱼性腺产卵控制将光周期调控为10h光照.ppt

目 录 实验一 海胆的受精作用和早期发育 实验二 海胆卵的结构 实验三 斑马鱼的早期胚胎发育 实验一 海胆的受精作用和早期发育 配子的获得 受精作用 胚胎发育 凝集和受精作用 自主创造性实验 一、配子的获得 KCl诱导海胆排放生殖细胞 操作方法： 用注射针管取1-3 ml 0.5M KCl，由海胆口面围口膜处注入体腔中（可分多个点注射） 将注射后的海胆反口面朝上放于盛有海水的培养皿中，数分钟后，生殖细胞将由反口面的生殖孔处排出，辨别雌雄后（卵子为橙黄色，精液为乳白色） 将雌海胆反口面朝下置于烧杯口上，杯内事先加入海水以收集卵子（水深以刚好浸没雌性生殖孔为宜），卵子至少需洗涤2次（过滤海水）以除去水中的体腔液和其他杂质 雄海胆反口面朝下置于预冷的烧杯口处，当大滴的白色精液滴入烧杯内后，移去海胆，用保鲜膜密封培养皿，低温（5-10℃）保存精液 分别观察未受精卵结构和精子悬液（10ml海水中加入1滴精液），确定精子的活力 二、受精作用 将几滴洗过的卵子悬液加入盛有100ml海水的容器中，然后再加入1滴稀释过的精子悬液，轻轻混匀 立即吸取精卵混悬液于凹玻片上，加盖玻片后，于镜下观察 记录受精膜起始举起和完全举起的时间 三、胚胎发育 培养方法：室温（15-20 ℃ ）；正常过滤海水；换水（1-2次/天，1/3/次） 棱柱幼虫后开始投喂单细胞饵料，投喂量以水色为淡藻色为宜，2次/天（早晚各1次） 观察：定期于镜下观察并记录达到各主要发育阶段的时间 四、凝集和受精作用 卵水可激活海胆精子并引起精子凝集 卵水的制作：将未受精卵放入盛有一定海水的试管里，塞住试管口，激烈摇动以去除未受精卵外的胶膜，过滤得滤液即为卵水 取少量卵水与胚胎手术皿中，按照精子悬液和卵水1:3（体积比）的比例使二者混合 1min后可见混合液中出现颗粒状或凝絮状，显微镜下精子凝集成从，且精子的头部都集中于中心 或者滴加卵水于在玻片上，加1滴精子悬液，立即于显微镜下可直接观察到精子凝集的过程 五 自主创造性实验 外界因子对海胆早期胚胎发育的影响 要求： 自行确定环境因子，每个因子设定不同的梯度（4-6个为宜） 按前述方法培养 观察分析结果（胚胎颜色，发育速度，存活率，畸形率等） 实验二 海胆卵的结构 一、从一个分离的分裂球发育成完整的 胚胎 二、原肠外凸 三、人工单性生殖 一、从一个分离的分裂球发育成完整的胚胎 按前述实验方法获得卵子和精液 将一些卵子加入盛有一半过滤海水的试管中，加1滴精子稀释液，塞住试管口。倒转试管1次，以混合精子和卵子 待加入精子1min后，用力持续振摇试管2-3min，以使受精膜破裂 将试管内容物倒入胚胎手术皿中，定时观察，待第1次卵裂刚刚完成，用吸管吸一定量海水用力吹打胚胎数次，待胚胎停顿下来，镜下检查分开的分裂球 （也可使用无钙人工海水处理刚刚开始分裂的卵子，当卵裂完成后再用海水吹打，待细胞分离后，将细胞移入正常海水中 转移分离的分裂球于小烧杯中，按前述方法培养至长腕幼虫 比较正常胚胎或幼虫与分离卵裂球发育的胚胎或幼虫的大小 二、原肠外凸 不同化学试剂可以使海胆胚胎“动物化”或“植物化” 氯化锂（LiCl）使海胆原肠外凸 按照前述实验方法获得配子和人工受精 分别于受精后4h，24h，36h吸取胚胎，并将其加入不同LiCl浓度的海水中 镜下观察记录原肠外凸现象并与正常胚胎比较期发育速度 三、人工单性生殖 MgCl2、KCl、蔗糖、尿素等能引起海胆卵子激活和卵裂 实验方法： 高渗液的配制（正常海水、海水的1.5倍、2倍和4倍） 按照实验一方法获得未受精卵 将未受精卵移入盛有不同浓度海水的手术皿中，处理5分钟，倒掉高渗水，用正常海水洗卵3次 镜下观察（是否有受精膜举起，卵裂是否发生） 实验三 斑马鱼的早期胚胎发育 一、斑马鱼性腺促熟和产卵调控 二、斑马鱼早期发育活体观察 三、自主创造性实验 一、斑马鱼性腺产卵控制 将光周期调控为10h光照，14h黑暗，再次亮灯后不久雌鱼便产卵 雌雄鱼须置于一网孔大于1mm的繁殖网中或者用上述网孔大小的隔板分割亲鱼与卵 二、斑马鱼早期发育活体观察 三 自行创造性实验 外界因子对斑马鱼早期胚胎发育的影响 要求： 自行确定环境因子（环境理化因子，污染物，药物等） 每个因子设定不同的梯度（4-6个为宜） 按前述方法培养 观察分析结果（胚胎颜色，发育速度，存活率，畸形率等） * 制作人： 张志峰 实验内容 实验内容 ♀ ♂ *