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学院： 专业： 姓名： 学号： 实验六 聚合酶链式反应 PCR 和PCR产物纯化 实验目的 了解PCR反应的基本原理。 了解PCR反应的优化条件和PCR的应用。 掌握PCR产物纯化的方法。 实验原理 PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的技术。1990年，Kary B.Mullis发明了PCR技术，并因此在1995年荣获诺贝尔化学奖。PCR技术使分子生物学研究一下子获得了突破，并且随着PCR技术的日趋完善，PCR技术在人类生活中的应用也越来越广泛。PCR、分子克隆和DNA序列分析构成了现代分子生物学实验工作的基础。PCR反应包括三个基本步骤：①变性：目的双链DNA片段在94℃下解链；②退火：两中寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对；③Tap DNA聚合酶在最适温度下（72℃），以目的DNA合成。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍。这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25~35轮循环就可使目的DNA片段扩增达106倍。 实验步骤 PCR反应 ⑴在EP管中依次下列试剂（50μl反应体系） 试剂 用量/μl 灭菌H2O 35.5 PCR反应缓冲液 5 DNTP 4种，每种浓度10μmol/L 2 上游引物 2 下游引物 2 模板DNA 1 Taq 0.5 ⑵摇匀后稍离心，在放入PCR仪中 将PCR产物全部用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。 用干净锋利的小刀将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5ml离心管中。 按1:3比例加入Extraction Buffer 中。 于恒温水浴中50℃温育，直到凝胶融化。 将融化后的混合液全部转移到Spin Column内，于6000g离心1分钟，并弃去接液管内液体 将Spin Column内加入500μl Extraction Buffer,于12000g离心60s，并弃去接液管内液体。 向Spin Column内加入750μl Wash Buffer于12000g离心60s，并弃去接液管内液体。 再次于12000g离心1分钟，然后将Spin Column转移到无菌的1.5ml离心管内。 向Spin Column内加入20μl Elution Buffer并于室温静置1分钟。 于12000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段 取50μl进行琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。 实验结果与分析 ① ② 实验结果：通过PCR三个步骤，解链---退火---延伸，电泳后得到了DNA的片段，如图①，我的实验结果为10号所显示的图像；再经过DNA的纯化，电泳后得到了DNA的片段长度，如图②，我的实验结果为3号所显示的图像，DNA的长度在600bp上。 分析：图①中10号图像比较清晰，说明在操作过程无很大的失误，无污染，为后面的实验做了一个很好的基础。 图②中3号图像的DNA 的片段长度为600bp，可能在操作过程中因操作不当，有些被污染，导致在图像中有些模糊的亮线；