比较头孢他啶对粘质沙雷氏菌和阴沟杆菌AmpC酶诱导作用的实验研究.pdfVIP

中文摘要 前 言 革兰氏阴性杆菌对13一内酰胺抗生素的抵抗，已成为今天临 床抗感染治疗面临的极为严重的问题。现认为，在革兰氏阴性杆 菌中，导致p一内酰胺抗生素耐药现象的主要机制是产生B一内 酰胺酶。其中由AinpCl3一内酰胺酶引起的细菌耐药日益增多。 AmpCl3一内酰胺酶属Bush—J—M，群，是不被克拉维酸抑制的“丝 氨酸”头孢菌素酶，具有被B一内酰胺抗生素诱导合成的特性，主 要存在于肠杆菌属、柠檬酸杆菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、铜绿 假单胞菌、大肠埃希氏菌、致贺氏菌、克雷伯杆菌等菌属中。 染色体编码的诱导性AmpCl3一内酰胺酶的表达受amp复合 表现型密切相关。产生AmpC酶的肠杆菌主要有四种表现型：野 生型(正常可诱导酶)、高诱导型(AmpC酶基础表达水平升高和诱 导剂在低水平时即表现高水平诱导)、温度敏感型(在不适温度下 丧失诱导能力)及稳定的去阻遏表达型(持续高水平表达AmpC 酶)。其中以稳定的去阻遏表达型对临床治疗危害最大。这一表 现型中ampD的突变主要表现为氨基酸的替代或含羟基末端的氨 基酸的突变。 肠杆菌科的大部分机会病原菌曾一度被当作非致病菌而被忽 视。随着医疗技术的发展，包括各种手术、检查器械、导管、输液、 抗菌剂和免疫抑制剂等的频繁及大量应用，给机会病原菌的感染 创造了条件。其中，粘质沙雷氏菌和阴沟杆菌是引起下呼吸道感 染的常见肠杆菌科细菌，在气管切开或做机械辅助通气的病人尤 为严重。因此，要彻底解决临床上因高产AmpC[3一内酰胺酶而引 起的细菌耐药问题并不是轻而易举的。一方面通过积极寻找和设 计新型抗生素和酶抑制剂来缓解目前严峻的局面；另一方面从临 床医生的角度来讲合理应用抗生素，尽量避免高产AmpC酶的诱 导合成。因此?本实验以头孢他啶为诱导剂，分别对粘质沙雷氏菌 及阴沟杆菌诱导产生AmpC酶展开研究，希望为临床合理应用抗 生素提供科学依据。 ／ 【实验材料与方法 一、实验材料 1．菌株来源 2001年6月一2002年6月我院呼吸科病房住院病人中分离 出的粘质沙雷氏菌23株及阴沟杆菌40株。标准菌株029M、029、 1194e由协和医科大学细菌室惠赠。 2．实验试剂 头孢他啶，头孢西丁，头孢唑林，青霉素，M—H培养基， APl20e菌种鉴定条，药敏纸片，E—test纸条，胰蛋白胨大豆胨肉 汤，克拉维酸干粉，考马斯亮兰(G!，。)，两性电解质载体(pH=3．5 7一亚 —10)，碘，碘化钾，淀粉，TaqDNA聚合酶，丙烯酰胺，N，N 甲双丙烯酰胺。 3．实验仪器 电热恒温培养箱，恒温水浴震荡器，低温高速离心机，深低温 冷却装置，DNA扩增仪。 二、实验方法 ·2- 1．菌株的采集与鉴定 2．药敏试验及头孢西丁诱导实验 3．头孢他啶筛选实验 4．B一内酰胺酶的提取 5．等电点聚焦电泳及克拉维酸抑制实验 6．AmpC酶活性测定 7．三维试验检测突变菌株 8．DNA抽提 9．PCR扩增 10．PCR产物纯化后测序 11．统计学分析：应用方差分析法和x2检验。 实验结果 一、产可诱导AmpC酶肠杆菌的表型分布 临床分离到粘质沙雷氏菌23株和阴沟杆菌40株，其中药敏 试验结果对三代头孢菌素及单环类抗生素敏感或中介的粘质沙雷 实验结果显示，野生型粘质沙雷氏菌12株(52．17％)，阴沟杆菌 8株(20％)。 二、头孢他啶筛选实验后AmpC酶活性测定 野生型粘质沙雷氏菌、阴沟杆菌及高诱导型粘质沙雷氏菌经 几乎检测不出AmpC酶的活性；对于高诱导型阴沟杆菌，经2MIC e 的头孢他啶诱导后AmpC酶的平均活性为1．6280．516mmol／mg