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第一章 分子生物学的基本操作 分子生物学研究从20世纪中叶开始高速发展的最主要原因—— 现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 1.3 基因扩增 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence Target Amplification 在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。 在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。 1.5 基因工程载体 质粒载体DNA的分离——碱裂解法 碱裂解法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。 在pH大于12的碱性条件下染色体DNA的氢键断裂双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH恢复至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心染色体DNA与不稳定的大分子RNA蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。 1.5.2 重要的大肠杆菌质粒载体 1.5.2.1.? pSC101质粒载体 1.5.2.2.??ColE1质粒载体 ColE1质粒属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。此时，松弛型复制控制的质粒DNA仍然可以继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的ColE1质粒拷贝数增加到1000~3000个之多，质粒DNA大约可占细胞总DNA的50%左右。由此可见，由于质粒拷贝数高，插入的外源DNA片段的产量也就得到相应的提高。 ??? 思考题 ———借助PCR手段完成 本章要点 分子生物学操作常用工具酶的作用 细菌转化 PCR 基因工程载体 重组子筛选方法（pBR322、pUC18/19) 复习题 细菌转化操作流程 PCR原理与步骤 基因工程载体的特点 Target Sequence Target Sequence 每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon PCR仪 1.4 核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如： DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶