纤维环源干细胞的分离和表征-2012-4-10.docVIP

纤维环源干细胞的分离和表征 09级临床医学 赵燕南 指导教师 李斌 摘 要：椎间盘退变是引起腰痛等高发性疾病的重要因素之一，但通过常规手术往往难以达到根治效果。随着组织工程技术的发展，通过培育仿生椎间盘以替代病变组织这一新思路逐渐趋于可行。其中，组织工程化纤维环的制备是仿生椎间盘成功的关键环节。本研究从组织工程的两大要素之一即种子细胞出发，旨在从纤维环组织中分离具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，作为纤维环组织工程的种子细胞。我们从兔纤维环组织中分离纯化出纤维环源细胞，利用MTT法对其增殖能力进行测定，利用免疫荧光法对其干细胞标志蛋白表达进行表征，并对其成脂、成骨、成软骨等多向分化潜能进行检测。发现该细胞具有形成集落和自我更新能力，表达干细胞标记蛋白，成脂诱导后产生脂滴，成骨诱导后产生钙结节，茜素红染色阳性，成软骨诱导后蕃红O染色阳性。综合各方面表征结果，可证实其所分离得到的纤维环源细胞为干细胞（命名为纤维环源干细胞），为后续研究打下基础。 关键词：椎间盘；组织工程；纤维环源干细胞；细胞增殖；多向分化潜能 Abstract: IVD degeneration is a major cause to lower back pain, a high-incidence disease in humans. Recently, tissue engineering of IVD has evolved into a promising approach for regenerating diseased discs. One key point is to find an ideal cell source for obtaining engineered AF tissues through a tissue engineering approach.In this study, a population of cells derived from rabbit annulus fibrosus (AF) tissues was isolated. The proliferating capability of cells was evaluated by MTT, common stem cell marker expression was examined using immunofluorescence, and multi-differentiation potential including adipogenesis, osteogenesis and chondrogenesis was assayed using specific inducing medium and staining solution. The results showed that the AF-derived cells possess the characters of stem cells, which can be used in further study. Key Words: Tissue engineering of IVD;AF-derived cells; proliferation; multi-differentiation potential 引言 椎间盘退变是引起腰痛等高发性疾病的重要因素之一，造成的经济损失及医疗费用十分高昂。因此，对椎间盘退变的治疗具有巨大的经济和社会意义。但手术治疗会造成脊柱结构改变,甚至可引发临近节段退变，导致更严重的脊柱疾患1,2。随着组织工程技术的日益发展，通过培育仿生椎间盘以替代病变组织这一新思路逐渐趋于可行。 椎间盘由位于中央位置的髓核和周围的纤维环构成，其中髓核由髓核细胞及其分泌的II型胶原和蛋白多糖组成，起吸收震荡的功能。纤维环由高度有序的胶原束构成，起保护髓核的作用3,4，但其细胞类型和基质组成较为复杂。在靠近髓核的内区，主要由软骨样细胞、纤维软骨细胞及其分泌的II型胶原蛋白和软骨聚集蛋白聚糖等组成；最靠外的外区，主要由纤维样细胞及其分泌的I型胶原蛋白、纤调蛋白和核心蛋白多糖等组成；而介于二者之间的中间区的细胞和基质类型则是内外二区的综合5。过度重复力学加载或年龄的增大，都会使纤维环的结构改变，产生断裂，导致髓核受力发生变化，并最终引起椎间盘的退变6,7。因此，成功的椎间盘组织工程离不开具有足够力学强度的仿生纤维环的构建8。 纤维环组织工程的两大核心问题是支架与种子细胞。支架起模板作用，为种子细胞生长、分化及基质合成提供良好的微环境。种子细胞是基质表达的关键，其自我更新和增殖能力是组织工程纤维环维持其生化功能和力学强度的基础。在既有的纤维环组织工程研究中，种子