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第一部分微生物的利用 实验一 大肠杆菌的培养和分离 实验目的 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理 1.1微生物 1.1.3细菌的形态结构和菌落 1.1.3.3菌落 1.2微生物培养基 1.3无菌技术 1.3.3.1消毒 1.3.3.2灭菌 2.微生物实验所需的操作技术 2.2培养液的配置、灭菌，放斜面和倒平板技术 分装、放斜面、倒平板 倒平板操作 倒平板操作中的问题讨论 2.3.1平板划线法 平板划线法操作的问题讨论1 平板划线法操作的问题讨论2 2.3.2稀释涂布平板法 3.大肠杆菌的培养和分离实验 3.3实验过程 3.4课题成果评价 4.课题小结 * * 一. 基础知识 （一）微生物 （二）微生物培养基 （三）无菌技术 二. 微生物实验所需的操作技术 三. 大肠杆菌的培养和分离实验 四. 课题小结 结构都相当简单，个体多数十分微小，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。且体内一般不含有叶绿素，不能进行光合作用 五类 病 毒 细 菌 放线菌 真 菌 原生动物 病毒界 原核生物界 真菌界 原生生物界 1.1.1微生物的特点 1.1.2微生物的种类 1.1.3细菌的形态、结构和菌落 图1-1 常见的三种细菌典型形态 A.球菌 B.杆菌 C.弧菌 单细胞不分枝的原核微生物，细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察 1.1.3.1细菌的形态 1.1.3.2细菌的结构 基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中有液泡、储存性颗粒、核质等 附属结构：鞭毛、纤毛、荚膜、芽孢（抗逆休眠体）等 1.1.3.3菌落 革兰氏染色：阳性或阴性，细胞壁成分不同 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落 细菌的菌落特征因种而异 菌落是鉴定菌种的重要依据 大肠杆菌 大肠菌群 培养基（培养液）是微生物生存的环境和营养物质 1.2.1培养基的分类（按物理形态分） （1）液体培养基（液） （2）半固体培养基 （3）固体培养基 添加的琼脂量决定 1.2.2培养基所含的成分 （1）水 （2）无机盐 （3）碳源 （4）氮源 （5）生长因子 含碳无机物或有机物，后者通常可作能源 含氮无机盐或有机物，用于合成氨基酸等 生长必需，而自身不能合成的化合物 不同微生物所需无机盐、碳源、氮源和生长因子的种类不同 培养基需要调节pH、渗透压、控制含氧量等条件 细菌：用蛋白胨和酵母提取物配制 霉菌：用无机物或添加蔗糖的豆芽汁配制 细菌：中性偏碱（7.5~8.5） 霉菌：中性偏酸 （5.0~6.0） 通常用NaCl调节 1.3.1获得纯净微生物培养物的关键 防止外来杂菌的入侵 1.3.2无菌技术 的四个方面 （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌 （3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行 （4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触 1.3.3消毒与灭菌 使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物 一般不能杀死芽孢和孢子 常用消毒方法 常用于牛奶的消毒 煮沸消毒法 巴氏消毒法 紫外线消毒 化学药剂消毒法 酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等 在充分燃烧层灼烧 使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 常用灭菌方法和适用范围 灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌 微生物的接种工具 （接种环、接种针）或其他金属用具 能耐高温的需要保持干燥的物品（ 玻璃器皿） 160－170℃ ；1－2h 100kPa 121℃ 15—30min 最常用方式，通常用于培养基的灭菌及各种器具的灭菌 2. 1器具的灭菌 2.2培养液（基）的配置、灭菌，放斜面和倒平板技术 2.3细菌的接种和纯化技术 棉花塞口 牛皮纸（或报纸）包口或包扎 60~80℃烘干 121℃（1Kg/cm2）灭菌15min 不能用脱脂棉：易吸水后导致污染 2.3.1平板划线法 2.3.2稀释涂布平板法 简便，常用 效果好 2.2.1配置LB（Luria-Bertani，溶菌肉汤）培养基 配方 蛋白胨：0.5g 酵母提取物：0.25g NaCl：0.5g 水：50mL 琼脂：1g（固体） pH：7.4～7.6 配制过程 计算、称量 混合加热 溶化 NaOHHCl 调pH（7．6） 分装 三角漏斗分 三角瓶 试管 棉塞或封口膜 加塞 包扎 通气；阻止微生物进入 牛皮纸 灭菌 高压蒸汽 1Kg/cm2，121℃， 1