鲈鱼酰基辅酶A结合蛋白Acbp基因cDNA的克隆和诱导表达.pdfVIP

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(1): 20−26 鲈鱼酰基辅酶A 结合蛋白Acbp 基因cDNA 的 克隆和诱导表达 钱云霞 　杨孙孝　童丽娟　宋娟娟　钱　伦* (宁波大学生命科学与生物工程学院, 应用海洋生物技术教育部重点实验室, 宁波 315211) 摘要　　酰基辅酶A结合蛋白(acyl-CoA-binding protein, ACBP)对长链脂酰基辅酶A(long-chain fatty acyl-CoA esters, LCACoA)有很高的亲和力, 因而对LCACoA在细胞内的运输和利用过程起重 要的作用。本文采用RACE 技术从鲈鱼肝脏中克隆了Acbp 基因的全长cDNA 序列, 该基因全长 cDNA 679 bp, 5’ 端和3’ 端的非翻译区分别为83 bp 和326 bp, 开放阅读框为270 bp。推测编码89 个氨基酸, 理论等电点为5.44, 分子量为10.14 kDa。鲈鱼Acbp 与青鳉鱼、银鳕鱼、大西洋鲑和人 的同源性分别为87%、84%、78% 和68%。用RT-PCR 和实时定量PCR 检测鲈鱼肌肉、心脏、眼、 大脑、消化道、肾脏、脂肪组织、脾脏、鳃和肝脏等10 种组织的Acbp 基因的表达情况, 结果表 明, 在肾脏和肝脏的表达量高, 肌肉、眼睛和大脑中表达低。定量PCR 检测表明鲈鱼肝脏Acbp 的 表达在饥饿时明显下降, 胰岛素上调其表达, 葡萄糖对其表达则没有影响。 关键词　　酰基辅酶A 结合蛋白; 鲈鱼; 克隆; 表达 长链脂酰基辅酶A(long-chain fatty acyl-CoA 我国重要的海水经济鱼类。对肉食性鱼类来说, 脂 esters, LCACoA)是脂肪代谢的中间产物, 最近的研究 肪是其主要的能量来源之一, 同时还提供鱼体生长发 发现LCACoA参与调节细胞的多种功能, 除了作为能 育所需要的必需脂肪酸, 但是过多的脂肪又会造成脂 源物质外, LCACoA 还是细胞膜的重要成分, 细胞的 肪在鱼体内大量沉积, 不仅会降低饲料转化率, 还可 主要信号分子, 在免疫系统中也有重要作用[1,2] 。酰 引发营养性脂肪肝。鉴于ACBP 在脂类代谢中的重 基辅酶A 结合蛋白(acyl-CoA-binding protein, ACBP) 要作用, 本研究从鲈鱼肝脏中克隆了Acbp 基因的 对酰基辅酶A尤其是LCACoA有很高的亲和力, 分子 cDNA全长序列并对其进行了同源性比较和分析, 同 量约为10 kDa。目前认为ACBP 是细胞内LCACoA 时探讨了该基因在不同组织的表达分布以及饥饿、 最主要的结合蛋白, 它能有效保护LCACoA不被硫酯 胰岛素和葡萄糖对肝脏Acbp 的表达影响, 以期为进 酶水解, 既是LCACoA 的受体, 也是它的供体, 同时 一步研究该基因的功能积累基础资料。 ACBP 又是LCACoA 的转运子, 它能将LCACoA运输 至线粒体进行β- 氧化, 运送到微粒体进行糖脂合成 1 材料与方法 和磷脂的合成[2~4] 。在哺乳动物中, ACBP 的表达和 1.1 实验材料 脂肪合成有关, 肝脏ACBP在脂肪细胞分化过程中明 克隆基因所用鲈鱼购自象山黄皮岙养殖场, 鲈鱼 显上调, 而饥饿会降低其表达, 这种调节可能跟胰岛 平均体重329±9.8 g 。Trizol 试剂为Invitrogen 公司 素的作用有关[4] 。Acbp 基因cDNA 序列已在哺乳动 产品。逆转录试剂PrimeScript™ 1st Strand cDNA 物、鸟类、两栖类、鱼类、昆虫、甲壳动物和 Synthesis Kit、实时定量PCR 试剂SYBR PrimeScriptTM 酵母以及各种植物中被克隆[1,2,5~7], 但鱼类报道的不多, RT-PCR Kit、DNase Ⅰ(RNase free)、dNTP、Taq DNA 在GenBank 和EMBL 中仅见银鳕鱼(Anoplopoma 聚合酶、DNA 凝胶回收试剂盒、 pMD18-T 载体等 fimbria )、大西洋鲑(Sal