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第九届中国北方实验动物科技年会会议论文
DJ1恻真核表达载体构建
pcDNA3．1／myc…His
及其在NIH3T3细胞中表达的研究
张梅英，王 惟，徐影琪，赵越，于 萌，杨 葳
(中国医科大学实验动物部，沈阳，110001)
摘
DJ-l啪基因的功能及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将第26位氨基酸进行突变，分别构
blot
1／myc．His．DJ．1悯重组表达质载体。
关键词：DJ-1；N1H3T3细胞；帕金森氏病 ，
1。1 材料
帕金森病(Parkinson’sDisease，PD)属于神经系统
退行性病变之一，其发病率呈逐年上升趋势，在65
岁以上人群中的患病率约为2％，其中大约10％
一15％呈现家族聚集性【l】，其主要症状是运动功能的 质体(Lipofectamine
改变，如运动过缓、静止震颤、步态畸形和姿势不
稳等；病变晚期出现不同程度的非运动功能障碍， 产品、胎牛血清为郑州佰安生物工程有限公司产
包括痴呆、抑郁、精神症状、自主功能缺陷、嗅觉 kit
品，Quickchange
及视觉的损坏，PD的病理学标志是黑质纹状体密 产品，凝胶回收试剂盒、Taq酶等购自宝生物(大
质部多巴胺能神经元的选择性丧失及路易小体的出 连)有限公司，反转录试剂盒为Promega公司产品，
现，很多研究显示PD是遗传因素和环境因素等多
M200
因素共同导致。DJ-1基因是近年来发现与PD发生酶标仪为瑞士TECAN公司InfinitePro型，流
相关的基因，DJ-1存在多种突变位点，包括L166P、式细胞仪为美国BD公司FACScalibur型。
1．2方法
M26I、R98Q、A104T和D149A等，研究表明
1．2．1
L166P、M26I纯合突变可以引起早发型常染色体隐
性遗传pDtl，21，但是其发病机制并不完全清楚。 用Primer5软件和突变试剂盒说明书要求设计合成
为此，我们构建pcDNA3．1／myc—His．DJ．1和
pcDNA3．1／myc．His．DJ一1瑚重组表达载体，并在
NIH3T3细胞中进行突变DJ．1U2S表达的研究。为 ：
1材料与方法 pTZ57R／DJ．1质粒进行实验操作，酶切鉴定后测序。
I
第九届中国北方实验动物科技年会会议论文
1 2．4阳性细胞克隆细胞活力检剥分别在96孔
限制性内切酶对pTZ57R／DJ．I和
pTZ57R]DJ．】DJ．IM261质粒进行双酶切．回收目的
细胞备5000个／孔，每孔培养基为100Ⅲ+每种细
片段，然后将其插入到peDNA3I／myc、His载体的多
克隆相应酶切位点．酶切鉴定后测序， 胞接种5个复孔，实验重复3改．于24h、48h、
1 2 3 DNA转染阳性细胞克隆筛遗及其鉴定 72la、96
1．231细胞转染及阳性细胞竟隆筛选采用脂质 养籍中孵育4h后．弃上清，每孔加入150山DM．
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