一个小鼠未分化胚胎癌细胞特异cDNA的分子克隆.pdfVIP

遗传 学报，11(5);325331，1934 ActaGeneticaSinica 一个小鼠未分化胚胎癌细胞特 异。DNA的分子克隆 许 以盛 P.Brulet 中〔国科学院昆明动物研究所） 法（国巴斯德研究所细胞遗传室） 用胚胎癌细胞株 E（C)PCC，的 poly(A)+RNA及质粒 PBR322在大肠杆菌中建立了一 个 cDNA文库。用另一株EC细胞H，及由EC细胞衍生的分化细胞株滋养层母细胞癌 TDMr 的 ’PcDNA 作探针，对 PCC3cDNA文库作了差别筛选。 自3,000个 cDNA克隆中筛出 25个克隆。其中1个克隆 MS，含有长 250bp的cDNA。用MS3cDNA作探针，在 1i，细胞 中能检出1个占poly(A)+RNA约 0.2-0.4%、长 6kb的RNA (MS3RNA)。用点印迹杂 交及 Northern印迹杂交分析法，证明 MS3RNA还存在于供试的另2株未分化 EC细胞株 PCC,,PSA,-NG：中。在供试的全部分化细胞株，即 TDM,,PSA1-2,3/A/1-D3,C17--S1`T384 中，均查不到 MS3RNA。用 Southern印迹杂交分析法，证明MS3基因在小鼠基因组中存在着 大量的拷贝，对小鼠胚胎基因文库的筛选表明，MS3基因有一个中等重复的基因家族，这个家 族在小鼠基因组中约有3,000个成员。 小鼠胚胎在 816个细胞阶段发生第一次细胞分化，产生两种不同的细胞，即仍然保 持全能性的小鼠胚胎内细胞团细胞及另一种分化细胞滋养层细胞。研究第一次胚胎细胞 分化时基囚表达的调控需要有在这两种细胞中特异表达的分子探针。对于小鼠滋养层细 胞已经有了特异的单克隆抗体探针及cDNA探针8]「。对于内细胞团细胞，我们分离和纯化 了一个适用于两相电泳分析的标志蛋白1]‘。本文介绍我们用分子克隆技术把畸胎瘤系统 作为体外模型为内细胞团细胞克隆了一个 cDNA探针。使人感兴趣的是编码这 。DNA 的基因在小鼠基因组中有一个中等重复的基因家族，这为研究协调地调控一个大基因家 族的细胞特异表达机理提供了一个很好的模型系统、、 材 料 和 方 法 一（）细胞 细胞株的培养按所列的文献进行，PCC3/A/1[],PSA1-NG2[191,F尸 为EC细胞株；TDM1[201,PYS-2E1.,3/A/1-D3[21],C17-S1-T384[15，分别为滋养层母细胞瘤、 腔壁卵黄囊细胞、胚胎纤维母细胞及肌母细胞株。 二（）细胞总RNA及 poly(A)+RNA 的制备 所用的细胞均在指数生长期。 总RNA按Auffray等41〔法提取，然后按 Schimke法2[3［1用 oligo(dT）纤维素柱层析法制 备poly(A)-RNA。 三（）cDNA 文库的构建 按Wickens等，〔，‘法制备双链 cDNA，按Villa-Komaroff 本文于1983年8月21日收到。 本项工作系在法国巴斯德研究所F.Jacob教授实验室进行；本文曾经眺鑫教授、潘清华教授审阅，特此一井 致谢。 326 遗 传 学 报 1l卷 等2[7]法建立重组克隆，按Kushner[17，法转化大肠杆菌C600U (M)DNA 的制备 高分子量 DNA按 Blin等71〔法，质粒DNA按Katz等，〔，‘法 制备。DNA 的限制性内切酶的水解按各生产厂的规定进行。 五（）核酸的标记法 ’ZPcDNA系按Wickens等28〔，法由poly(A）十RNA合成，比 活力为 1-3X107cpm/Z,g。重组质粒用缺口翻译法[22［1标上 ’2P，比活力为 。.3-2X10 CPM/no 六（）印迹杂交法 点印迹杂交按Thomas[26，法，Southern印迹杂交按Southern[251 法，Northern印迹杂交按Thomas2[6，法进行。 七（）cDNA 及基因文库的筛选 菌落原位杂交按 Grunstein等[1［2]及 Hanahan 等13〔7法进行。小鼠基